野生与野生抚育猫爪草药材的分析比较研究

本研究对野生与野生抚育猫爪草药材进行了理化鉴别、薄层色谱试验、紫外光谱试验、多糖和氨基酸含量测定试验等的系统比较和分析，为猫爪草资源的开发和质量评价提供基础数据。

（一）材料与仪器

1．药材　猫爪草野生样品和猫爪草野生抚育样品由山东济南宏济堂制药有限公司提供。

2．试剂　葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所出品，批号110833－200302）、苯酚及其他试剂均为分析纯。18种氨基酸混合标样储备液（美国Sigma公司出品）。

3．仪器　紫外可见分光光度计（PE Lamda12）；气相色谱仪（岛津GC14B）；液相色谱仪（Waters515）；氨基酸自动分析仪（日立L－8800）。原子吸收光谱仪（Z27000），原子荧光光谱仪（AFS－230）。

（二）植物性状比较和理化特性鉴别

1．植物性状比较　野生样品和野生抚育样品均为干燥块根呈纺锤形，多5～6个簇生，形似猫爪，长3～10mm，直径2～3mm，顶端有黄褐色残茎或茎痕。表面黄褐色或灰黄色，久存色泽变深，微有纵皱纹，并有点状须根痕和残留须根；质坚实，断面类白色或黄白色，空心或实心，粉性；气微，味微甘。两种样品相比较，仅是野生抚育样品表面偏褐色，其余相同。生药学鉴别野生和野生抚育猫爪草的性状基本一致，并均符合中国药典2005年版一部猫爪草项下的规定。

2．理化性状鉴别

（1）显微鉴别：野生样品和野生抚育样品的横切面上，表皮细胞切向延长，黄棕色，有的分化为表皮毛，微木化，皮层为20～30列细胞组成，壁稍厚，有纹孔；内皮层明显；中柱小，木质部、韧皮部各2束，间隔排列；薄壁细胞充满淀粉粒。野生和野生抚育样品显微鉴别相同，并均符合中国药典2005年版一部猫爪草项下的规定。

（2）化学鉴别：分别取野生与野生抚育猫爪草药材样品，粉碎，各称取粉末1g，加95%乙醇10ml，水浴上加热20min，滤过，取续滤液2ml，加茚三酮试液1ml，水浴上加热数分钟，溶液均显紫红色。两种样品的化学鉴别反应相同。

（3）荧光鉴别：分别取野生与野生抚育猫爪草粉末1g，加70%乙醇10ml，水浴上温热提取10min，滤过，取滤液2ml置试管中，在紫外光灯365nm下观察，溶液显黄绿色荧光。野生和野生抚育样品荧光鉴别结果相同。

（三）主要化学成分的薄层色谱与紫外光谱比较

1．薄层色谱鉴别

（1）取野生和野生抚育猫爪草粉碎，各称取1g，分别加入甲醇10ml，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣各加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液。按照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，分别吸取上述2种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷－丙酮－醋酸乙酯（5∶2∶1）为展开剂，展开，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液显色，置110℃下烘烤至斑点显色清晰。在两种供试品色谱相应的位置上显相同的蓝色斑点，斑点Rf值一致。

（2）取野生和野生抚育猫爪草粉碎，各称取0．5g，分别加入醋酸乙酯10ml，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣各加2ml醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液。按照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，分别吸取上述2种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯－醋酸乙酯－甲酸（10∶2∶0．3）为展开剂，展开，晾干，喷以30%硫酸乙醇溶液显色，置105℃下烘烤至斑点显色清晰。在两种供试品色谱相应的位置上显相同的紫色斑点，斑点Rf值一致。

2．紫外吸收光谱　取野生和野生抚育猫爪草粉碎，各称取0．5g，置锥形瓶中，加入20ml乙醇超声30min，滤过，取续滤液1ml于10ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，作为供试品溶液。以乙醇作为空白，在200～400nm范围内扫描，记录紫外吸收光谱。结果野生和野生抚育猫爪草的乙醇提取物紫外吸收光谱基本一致，见图2－1。

图2－1　乙醇提取物紫外吸收光谱

A．野生样品；B．野生抚育样品

3．薄层色谱与紫外吸收光谱对比结果　在两种不同的提取方法与不同的色谱条件下，薄层色谱对比试验中野生与野生抚育样品的薄层色谱斑点数目、颜色、大小、Rf值基本一致；野生和野生抚育猫爪草的乙醇提取物的紫外吸收光谱亦基本一致。结果表明，野生与野生抚育的猫爪草中的主要化学成分基本相同。

（四）多糖含量的比较实验

猫爪草中所含的多糖是重要的抗肿瘤活性成分，我们采用比色法对野生与野生抚育药材样品中的多糖进行对比实验。

1．样品溶液制备　分别精密称取干燥至恒重的野生与野生抚育药材样品各约0．2g，置索氏提取器中，依次用乙醚和乙醇各100ml回流提取2h，残渣挥干溶剂后连同滤纸置烧瓶中，加入50ml水，加热回流提取2h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，放冷，转移至100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。

2．紫外可见光谱比较　分别精密吸取野生和野生抚育样品溶液各0．5ml，加蒸馏水使成1．0ml。再分别精密加入5%苯酚溶液2．0ml，摇匀，迅速精密加入浓硫酸8．0ml，充分摇匀，放置5min，于40℃水浴加热20min，冷却至室温。同时以蒸馏水作空白，在300～600nm波长范围内扫描葡萄糖标准品溶液（5．4546μg／ml）、野生与野生抚育猫爪草样品溶液的紫外可见吸收光谱图，结果见图2－1和图2－3。

比较紫外可见吸收光谱图2－2和图2－3可知，葡萄糖标准品溶液、猫爪草野生样品溶液与野生抚育样品溶液在490nm波长处均有最大吸收峰，其紫外可见吸收光谱亦基本一致，说明其多糖成分基本一致。

图2－2　葡萄糖对照品溶液紫外可见吸收光谱

图2－3　样品溶液紫外可见吸收光谱

A．野生样品；B．野生抚育样品

3．标准曲线制备　精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品约10mg置100ml容量瓶中，用水溶解并定容至刻度作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液0．2ml、0．3ml、0．4ml、0．5ml、 0．6ml、0．7ml、0．8ml，置具塞试管中，分别加蒸馏水使其成1．0ml。再分别精密加入5%苯酚溶液2．0ml，摇匀，迅速精密加入浓硫酸8．0ml，充分摇匀，放置5min，于40℃水浴加热20min，冷却至室温。同时以蒸馏水作为空白，在490nm处测定吸收度。以吸收度为横坐标（Y），葡萄糖含量为纵坐标（X），得回归方程：Y＝0．0785　X＋0．0093，r＝0．9992，在1．8182～7．2728μg／ml范围内线性关系良好。

4．样品含量测定　分别精密吸取野生和野生抚育样品溶液各0．5ml，加蒸馏水成1．0ml。再分别精密加入5%苯酚溶液2．0ml，摇匀，迅速精密加入浓硫酸8．0ml，充分摇匀，放置5min，于40℃水浴加热20min，冷却至室温。同时以蒸馏水作空白，在490nm处测定吸收度，同时以葡萄糖对照品溶液（5．4546μg／ml）作为随行标准，计算样品中多糖的含量。计算公式如下：

5．多糖含量测定　按样品的含量测定方法测定野生与野生抚育猫爪草中的多糖含量，结果野生和野生抚育猫爪草中的多糖含量基本一致，见表2－6。

表2－6　野生与野生抚育猫爪草多糖含量比较

6．不同采集期野生抚育猫爪草的多糖含量测定　取不同采集期的野生抚育猫爪草，按样品的含量测定方法测定，结果显示，11月、12月期间采集的野生抚育猫爪草样品的多糖含量较高。

（五）氨基酸含量的比较实验

采用氨基酸自动分析仪，按照检测方法GB／T5009，124－2003。在分离柱4．6mm×60mm（＃2622），柱温57℃，UV检测器温度136℃，氮气压力37kPa，缓冲液流0．40ml／min，茚三酮流速0．35ml／min。的实验件下，称取试样粉末各0．3g于玻璃水解管中，准确取15ml　6mol／L HCl，缓缓加入水解管，充分浸泡样后抽真空封管，将水解管置于110℃恒温烘箱中水22h，冷却，将试液摇匀，开管，用移液管移取1．0ml液于蒸发皿中并在100℃水浴锅上蒸干浓缩，完全移定容25ml，用滤纸过滤，后用0．45μm微孔滤膜滤，取样置氨基酸分析仪样品瓶上机测试野生与野抚育药材中的氨基酸种类和含量。结果（表2－7）野生野生抚育猫爪草的氨基酸种类基本一致，野生猫爪的总氨基酸含量为7．19%，比野生抚育的9%～10%稍低，在含量上两者略有差异。

表2－7　野生与野生抚育猫爪草中18类氨基酸含量的比较

（六）有害物质的测定

取野生和抚育猫爪草样品适量，按行业标准方法，分别测定铅、镉、砷、汞、铜5种重金属元素含量，结果见表2－8。

表2－8　野生抚育猫爪草中重金属元素测定结果

取野生和抚育猫爪草样品适量，按行业标准方法，采用气相色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅣQ有机氯农药残留测定法），分别测定农药六六六（BHC）、滴滴涕（DDT）、五氯硝基苯（PCNB）、艾氏剂（Aldrin）残留量，结果野生和抚育猫爪草的样品中均未检出BHC，DDT，PCNB和Aldrin。

取野生抚育猫爪草样品适量，按行业标准方法，采用液相色谱法测定黄曲霉毒素B1的结果为0．50μg／kg。上述野生抚育猫爪草有害物质的检测结果，符合WM／T　2－2004《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》的规定。

本实验对野生和野生抚育猫爪草的植物性状、理化特性和化学成分进行比较，并且对其中的主要化学成分进行定性和定量对比。结果表明，野生和野生抚育猫爪草的主要成分基本一致；在多糖含量上，野生猫爪草为14．1%，比野生抚育猫爪草的10%左右略高；野生与野生抚育猫爪草的氨基酸种类基本一致，野生猫爪草的总氨基酸含量为7．19%，比野生抚育的9%～10%稍低。野生猫爪草与野生抚育猫爪草基本一致，无明显差异，野生抚育猫爪草的有害物质检测符合规定。