渤海个野生群体遗传多样性的微卫星分析

真子渺等（1966，1969）曾根据对虾洄游先后到达顺序，认为黄、渤海群体可再分成先期来游群和后期来游群，将黄、渤海对虾分为三个种群。近年来，在韩国济州岛近岸发现中国对虾野生群体，但形成的来历尚不清楚。到20世纪90年代后期，人们从分子水平研究中国对虾种质资源状况，相建海等（1998）采用同工酶技术对中国对虾黄、渤海群体和朝鲜西海岸群体以及不同虾类的遗传背景进行了评估，石拓等（2001）运用RAPD技术对采自不同地点的中国对虾野生群体进行了分析，对遗传分化指数进行了计算。前人主要针对中国对虾遗传变异水平进行了研究（石拓等，1999；Liu et al，2000；Wang et al，2001），由于中国对虾具有洄游习性，且生殖洄游又回到其出生地，由此产生的地理群之间是否产生生殖隔离乃至遗传分化，尚未见进一步研究。刘萍等（2004）采用7对微卫星DNA引物对渤海湾群体（BH）、辽东湾群体（LD）和海洲湾群体（HZ）3个不同地理区域各20尾中国对虾的遗传多样性进行分析，探讨中国对虾的种质资源状况。

表1　实验用中国对虾的样品资料

7个微卫星的核心序列在GenBank中的注册号以及7对引物的退火温度见表2。应用7对微卫星引物对中国对虾3个地理群的60个个体进行了PCR扩增（RS1101位点的图谱见图1），获得了56个等位基因，不同的引物获得的等位基因数为3～16个不等，EN0033获得16个等位基因，等位基因数最多；RS0683次之，为12个等位基因；RS0859获得7个等位基因；EN0018、EN0201和RS1101各获得6个等位基因；EN0021只获得了3个等位基因。每个引物平均获得7.625个等位基因。通过基因产生的频率计算每个基因位点的多态性信息含量（PIC），EN0021位点提供的信息含量较低，为0.3174；其他6个基因位点的PIC值均在0.5以上，见表2。

表2　PCR反应条件以及中国对虾3个野生群体21个群体位点的杂合度值、P检验值

图1　中国对虾3个野生群体RS1101位点的微卫星检测图谱

运用TFPGA分析软件计算出各群体位点的期望杂合度和观测杂合度以及Hardy-Weinberg平衡检验P值。发现BH和HZ各有1个群体位点发生平衡偏离，而LD有1个群体位点发生平衡偏离，还有2个群体位点已发生显著平衡偏离，见表2。

表3　中国对虾3个野生群体的遗传距离和相似性指数

注：对角线以上数据为遗传距离，对角线以下数据为相似性指数。

根据Nei（1972）的方法对3个地理群间的遗传距离和相似性指数计算，结果表明BH和LD间的遗传距离最小，相似性最高，LD和HZ两地理群间次之，而BH与HZ的遗传距离相对较远。根据遗传距离值采用UPGMA聚类分析也可以反映出3个地理群间的关系，BH和LD遗传距离最小，亲缘关系最近，首先聚在一起；之后两者与HZ再进行聚合（图2）。

图2　中国对虾3个野生群体的UPGMA图

注：图下方的数值为遗传距离

通过AMOVA分析中国对虾3个地理群间的遗传分化指数Fst值（表4），可以看出，BH和LD两地理群间最小，表明两群体的遗传分化最弱；HZ与另两个地理群间则产生了中等程度的分化。从变异贡献率来看，有92.83%的遗传变异是来自个体之间，只有7.17%的遗传变异是来自群体之间（表5）。

表4　中国对虾3个野生群体的遗传分化指数（Fst）

表5　中国对虾3个野生群体的遗传变异组分

续表

十足目甲壳动物遗传变异性较低是其系统发生的一个基本特征（李思发，1988），Hedgecock等（1982）在总结了65种虾蟹类的平均杂合度后也得出相同的结论。较短的生活史造成的瓶颈效应及缺乏随机漂变被认为是甲壳类遗传变异较低的主要原因，且远低于无脊椎动物的平均水平，而人为干涉如过度捕捞、养殖个体逃逸、大规模不安全的人工放流以及产卵场环境条件的恶化等都有可能对对虾的遗传多样性产生影响。从20世纪80年代初期到90年代初期，年均渔获量已从最高峰的25.4.8t下降到10.5.3t，与60年代基本持平；自1990年以来，年捕捞量已不足3.0.0t，现在年均渔获量则不足1.0.0t。从1986年开始，我国每年在渤海、黄海北部和山东半岛南部放流人工繁育的对虾苗种10亿～30亿尾，黄、渤海沿岸中国对虾的补充群体已大多为人工放流群体（邓景耀等，2001），可能是中国对虾黄、渤海沿岸群遗传多样性水平较低的一个重要原因。本研究证实BH和LD间的遗传分化程度较弱，HZ与其他两地理群间的遗传分化均达中等水平程度。UPGMA聚类分析以及Nei氏遗传距离等验证了中国对虾各地理群间存在着不同程度的遗传分化。究其原因，可能是海洲湾地处黄海沿岸，与辽东湾和渤海湾之间存在水域差别，而栖息在不同水域的中国对虾在越冬洄游过程中完成交尾，不同水域区系间产生生殖屏障，阻断了基因交流，导致黄、渤海沿岸不同地理区系间的中国对虾产生了遗传分化。

由于微卫星序列具有高度可变的特性。所以无论在群体遗传学还是在个体识别以及亲子鉴定等方面都得到了广泛的应用。微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，因此，可以根据某个微卫星标记区分纯合显性个体和杂合显性个体。根据微卫星核心序列的侧翼序列保守性进行引物设计，就可以在该物种甚至近缘物种中进行微卫星多态性的分析。Wolfus等（1997）使用一对微卫星标记对来自不同地区的5个种群的凡纳滨对虾共312个个体进行了遗传分析，得到47个等位基因，获得了23个种群特异性标记，其中两个标记是家系特异性的。Sugaya等（2002）利用微卫星DNA标记对日本囊对虾的亲缘关系进行了分析。

中国对虾微卫星DNA标记研究起步较晚，但近年来已相继开展了这方面的工作（徐鹏等，2003；刘萍等，2004），取得了一定的进展。本研究中的结果进一步验证了本实验室筛选微卫星DNA标记的多态性以及这些引物在应用过程中可提供的多态性信息含量，本实验使用的EN0021的PIC值低于0.5，建议在应用过程中不予使用。其余6个标记显示的PIC值均大于0.5，可用于群体分析等。通过各基因位点显示的等位基因数也可以间接反映其多态性信息含量，等位基因数越多，其多态性信息含量也就越多，反之亦然。本研究结果还表明，中国对虾黄、渤海沿岸地理群间已经产生了一定程度的遗传分化。渤海沿岸的辽东湾群体存在杂合子缺失情况较之另外两个群较为严重，7个基因位点中有3个位点发生了平衡偏离，其中有两个位点呈显著的偏离；渤海湾与海洲湾2个群体各有1个群体位点发生平衡偏离。但从总体来看，3个群体的P检验的平均值均在0.40以上，基本处于平衡状态。由此可见，从中国对虾资源开发和可持续利用的角度出发，必须根据群体的遗传结构制定科学的保护措施。加强野生原种遗传多样性的监测和评估，避免盲目地增殖放流以及过度捕捞，降低中国对虾野生遗传资源的稀释和衰退速度，防止种质退化和优良性状的丧失，从而保证中国对虾这一优良种质得以可持续利用和健康发展。