血药浓度测定方法

由于地高辛有效血药浓度低，一般检测方法的灵敏度难以达到要求，目前常用的检测方法有高效液相层析（HPLC）和免疫测定法，后者又分荧光偏振免疫测定法（FPlA）、放射免疫法（RIA）、复合酶免疫法（EMIT），化学发光免疫分析法（CLIA）、克隆化酶免疫分析法（CEDIA）、时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）等。其中高效液相层析精确度高，能分离检测地高辛及其代谢物，有独特优势。CLIA法则可进行全自动分析，使误差达到最小化，而且可以随时插入急诊血样分析，从而为患者争得宝贵的治疗时机；而FPIA法灵敏度高（最小可检出量为0．01μg／L）、方法简便，测定速度快，最适于面对患者的常规应用，得到广泛应用，近年来的相关文献报道也多采用该种方法。RIA法历史悠久、结果可靠、价格便宜，至今仍在治疗药物监测活动中占有一席之地，在中西部广大中小城市的经济欠发达地区更是常用的方法。

（一）荧光偏振免疫分析测定法

仪器和试剂采用美国Abbott公司TDx荧光偏振免疫测定仪和地高辛试剂盒。

1．校正曲线制备　取地高辛标准品0．5ng／ml、1．0ng／ml、2．0ng／ml及3．0ng／ml各200μl，各加沉淀剂200μl，混匀，13　000 r／min，离心5min，取上清液各200μl放入各样品杯中，置于TDx分析仪内，并将地高辛试剂盒放入TDx分析仪中，参照试剂盒说明让仪器自动操作，制备校正曲线并贮存于仪器中。

2．样品测定　取地高辛对照品和患者血清200μl，各加入沉淀剂200μl，混匀，13　000r／min，离心5min，取上清液各200μl，分别放入各样品杯中，置于Tdx分析仪内，并将地高辛试剂盒放入TDx分析仪中，仪器自动操作并打印结果，根据地高辛对照品值校正样品测定值。

与其他免疫测定方法一样，FPIA也会受到地高辛样免疫反应物质（DLIS）的干扰，采用超滤离心-FPIA检测游离地高辛的方法，可以排除这种干扰。南京总院采用超滤离心-FPIA法测定游离地高辛浓度，并估算了12位伴有肾功能不全的慢性心衰患者血清地高辛总浓度和DLIS浓度。结果表明：实测地高辛游离浓度为（0．79±0．48）nmol／L；实测地高辛总浓度为（1．31±0．80）nmol／L，明显大于计算的地高辛总浓度［（1．05±0．64）nmol／L］（P＜0．01），表明患者血清中含有较多的DLIS。据称肝病、肾病患者、新生儿及妊娠妇女，体内均含有大量的地高辛样免疫活性物质，一种水溶性小分子物质，能与地高辛抗体具有较强的亲和力，因此有可能影响地高辛监测数据的准确性。这一现象对测定游离药物的临床意义是较好的验证。

（二）高效液相层析

1．柱前衍生化色谱条件　使用环糊精固相萃取柱进行样品处理，衍生化试剂为1－萘甲酰氯及催化剂4－二甲基氨基吡啶，色谱柱为硅胶柱（15cm×4．6mm，3μm）；保护柱为硅胶柱（1．5cm× 3．2mm，7μm）。内标物洋地黄毒苷；流动相为己烷∶二氯甲烷∶乙腈∶甲醇（36∶6．3∶5．4∶0．2），流速为1．6ml／min；检测波长217／340nm。线性范围：0．25～4．0ng／ml，检测底限0．25ng／ml。

2．被测定的主要代谢产物　该方法能够分别测定几种地高辛的代谢产物：地高辛苷元、地高辛苷元单糖、洋地黄毒苷、强心苷、20-R-二氢地高辛。