几种个别氨基酸的测定方法

1. 赖氨酸的测定

1)原理

通过利用铜离子阻碍游离氨基酸的α-氨基，使赖氨酸的ε-氨基可以自由地与1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)反应，生成ε-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取后，产物在波长390nm处有吸收峰，从而可测得样品中游离赖氨酸的含量。

2)试剂和材料

①氯化铜液: 称28.0g无水氯化铜，用水定容至1000m L。

②磷酸三钠溶液: 称68.5g无水磷酸钠，用水定容至1000m L。

③硼酸盐溶液(p H9.1～9.2): 称取54.64g带有10个结晶水的四硼酸钠，用水定容至1000m L。

④磷酸铜悬浮液: 搅拌情况下，把氯化铜液200m L，缓慢倒入400m L的磷酸三钠溶液中，把悬浮液以2000r/min速度离心5min，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3次，把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液定容至1L。

⑤1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)溶液: 吸取FDNB10m L用甲醇定容至100m L。

⑥赖氨酸-HCl标准溶液: 称取一定量赖氨酸-HCl，用水配制成200mg/L的工作标准液。

⑦100g/L丙氨酸溶液。

3)分析步骤

①称取通过40目筛的均匀试样1.00g，置于100m L烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl标准工作液5m L(相当于1mg赖氨酸-HCl)，连同试剂空白同时进行试验。

②向各烧瓶中加入25m L磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0m L，振摇15min吸取10% FDNB溶液0.5m L。置于各处理烧瓶中，将烧瓶置沸水中加热15min。

③取出烧瓶，立即加入1mol/LHCl溶液25m L，并不断摇动使之酸化和分散均匀。

④烧瓶中的溶液冷却至室温，用水稀释至100m L，取约40m L悬浮液进行离心。

⑤用25m L二乙基醚提取上清液3次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中，于65℃水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的体积数。

⑥吸取上述各处理液10m L，分别与95%乙醇溶液10m L混合，用滤纸过滤。

⑦用试剂空白液调零，测定样液A390，与赖氨酸-HCl标准液对照，求出样品中赖氨酸-HCl的含量。

4)说明及注意事项

①本法在0～40mg/L赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

②添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于实验中形成良好的线性关系。

③用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDNB的产物破坏，否则这些产物在390nm处存在干扰。

2.色氨酸的测定

1)原理

样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物(nor-harman)，具有特征荧光值，可以进行定量测定。

2)试剂和材料

①0.3mmol/L三氯化铁-三氯乙酸溶液: 称取三氯化铁(Fe Cl3·6H2O)41mg，加入10%三氯乙酸溶液溶解并定容至500m L。

②2%甲醛: 量取甲醛溶液(36%～38%)5.5m L，加水至100m L。

③色氨酸标准溶液: 称取10mg色氨酸，用0.1mol/LNa OH溶液溶解并定容至100m L，置棕色瓶中备用，使用时用水稀释成1mg/L的标准溶液。

3)分析步骤

①称取样品粉末100～200mg于离心管中，加入4m L乙醚，摇匀后过夜，以3000r/min速度离心。将乙醚提取液移入试管中，并用乙醚洗涤残渣3次，收集乙醚液于试管中，于40℃水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/LNa OH4m L，火焰封口，于110℃水解16～24h。水解液用4mol/LHCl溶液调节至p H6～8，用水定容至50m L，过滤备用。

②吸取滤液0.2m L，加入2%甲醛0.2m L和0.3mmol/L三氯化铁-三氯乙酸混合液2m L，摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10m L。在激发波长为365 nm，发射波长449nm条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含量。

4)说明及注意事项

本法在0～10mg/L色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

3. 苯丙氨酸的测定

1)原理

苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，其荧光复合物在激发波长365nm，发射波长490nm处可以产生最大荧光强度，与标准氨基酸对照，可求出样品中苯丙氨酸的含量，检测时加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增强这一反应。

2)试剂和材料

试剂均用分析纯试剂盒玻璃器重蒸馏水配制。

(1)二肽-茚三酮试剂

①5mmol/L亮丙二肽溶液: 称取L-亮氨酸-L-丙氨酸1mg，溶于1m L水中，临时配制。

②30mmol/L茚三酮溶液: 称取茚三酮534mg，溶于100m L水中，冰箱贮存。

③0.6mol/L琥珀酸盐缓冲液: 称取琥珀酸7.086g，加水约25m L，用4.8mol/LNa OH溶液调制p H5.88，加水至100m L，冰箱贮存。

临用前，3种溶液按顺序以1 2 5(体积比)混合。

(2)铜试剂

①25mmol/LNa2CO3-0.4mmol/L酒石酸钾钠溶液: 称取无水碳酸钠2.66g，酒石酸钾钠(含4份结晶水)113mg，加水至1000m L。

②0.8mol/LCu SO4溶液。

临用前将①、②两溶液按3 2(体积比)混匀。

(3)0.6mol/L三氯乙酸溶液

称取三氯乙酸98g溶于1L水中，临用前取0.6mol/L三氯乙酸稀释10倍，得0.06 mol/L的溶液。

(4)标准苯丙氨酸溶液

称取苯丙氨酸配制成6.6mg/L的氨基酸标准液。

3)分析步骤

(1)血清的去蛋白处理

吸取新鲜血清50～100μL和等体积0.6mol/L三氯乙酸溶液混匀，静置10min后，以4000r/min速度离心10min，吸取上清液用水精确稀释5倍。

(2)样品测定

吸取血清稀释液100μL，置于样品管中，另吸取苯丙氨酸标准液25μL，加0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL，然后两管均加水至200μL，同时做试剂空白分析。再向各管加入二肽-茚三酮试剂0.3m L，放在75℃水浴中保温80min(或65～70℃，保温约140min)。取出冷却，加入2.5m L铜试剂，振摇均匀，90min内在激发波长为385nm、发射波长472nm条件下，测定样品的荧光值，与苯丙氨酸标样作对照，求出样品游离苯丙氨酸的含量。

4)分析结果的表述

式中: X——丙氨酸含量，mg/L

f1——检样荧光值;

f2——标样荧光值;

f0——试剂空白荧光值;

m'——标样氨基酸质量，mg;

m——样品质量，mg。

5)说明及注意事项

①反应的温度、时间对荧光物质的生成有显著影响。60℃保温120min所得相对荧光值较低，苯丙氨酸含量略高时，测定值容易参差不齐，低于60℃相对荧光值更低，实验更加不稳定。将温度提高至65～70℃，相对荧光值增高，保温约140min以后荧光值不再显著增高，此时的测定值约为60℃保温120min时的2倍。将温度提高至75℃，相对荧光最高值提前在80min左右出现，维持半小时左右后逐渐减退。80℃以上相对荧光值显著降低，最高值更早出现。

②荧光物质的稳定性: 从保温完毕加入铜试剂后算起，相对荧光值约稳定90min，以后逐渐下降。

③苯丙氨酸和茚三酮、铜盐作用的产物如果没有二肽存在几乎不会有荧光产生。能促使产生荧光的二肽甚多，以L-亮-L-丙二肽的荧光值为100%，甘-L-丙则为95%，甘-d L-苯丙为75%，L-丙-L-丙为70%，L-丙-甘为30%，甘-L-色为28%。这些二肽单独和茚三酮作用都不显荧光，在p H5.8时，除苯丙氨酸外可产生荧光外，亮氨酸和精氨酸也可产生少量荧光，相当于等当量苯丙氨酸的4%，除此以外其他氨基酸均小于0.5%，可以认为对苯丙氨酸有较好的专一性。

④反应溶液的p H若低于5.8，产生的荧光较低，p H大于5.8则荧光增加，在p H6.8时达到最高值，但专一性下降。鱿鱼蛋白质能与三氯乙酸发生沉淀反应，对p H有较大影响，在实际操作中血清用量应限于10μL，用量过大会使三氯乙酸用量相应增多，除非用适量氢氧化钠中和，否则使荧光值降低甚至消失。

4. 酪氨酸的测定

1)原理

酪氨酸和1-亚硝酸-2-萘酚反应，生成有色化合物，此化合物在硝酸和亚硝酸钠存在的条件下加热会产生稳定的荧光物质，可用荧光法定量测定。

2)试剂和材料

试剂均用分析纯和玻璃器重蒸馏水制备。

(1)亚硝酸萘酚试剂

①1-亚硝酸-2-萘酚乙醇溶液: 称取1-亚硝酸-2-萘酚20mg，溶于100m L无水乙醇，于4℃下保存。

②3mol/LHNO2溶液。

③0.1mol/LNa NO2溶液，于4℃下保存。

临用前将①、②、③三种溶液按(2 3 3)体积混合。

(2)0.6mol/L三氯乙酸溶液

称取三氯乙酸98g溶于1L水中。稀释10倍即得0.06mol/L。

(3)1，2-二氯乙烷(Cl CH2CH2Cl)

(4)标准酪氨酸溶液(7.2mg/L)

称取L-酪氨酸18.0mg，先加入数滴浓盐酸，微热完全溶解后，加水至10m L，用氢氧化钠溶液中和到近中性，定容至100m L，置冰箱保存。临用时吸取贮存液2m L，定容至50m L。

3)分析步骤

(1)样品去蛋白处理

吸取新鲜血清50～100μL和等体积0.6mol/L三氯乙酸溶液混匀，4000r/min离心10 min，吸取上清液用水精确稀释5倍，即得稀释10倍的样品溶液。

(2)样品测定

①分别吸取样液100μL于具塞试管1; 标准酪氨酸溶液25μL和0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL于具塞试管2; 0.06mol/L三氯乙酸100μL于具塞试管3; 各管用水补充体积至200μL。

②将各管置于55℃水浴数分钟，加入新配制的亚硝酸萘酚试剂0.3m L，摇匀，55℃保温20min，保温后加水2.5m L，摇匀后再加三氯乙酸溶液3m L。充分振摇以便将多余的试剂抽提入二氯乙烷溶液中，4000r/min离心10min，将上层水溶液移至另一试管内，在180min内，于激发波长468nm、发射波长为555nm处，测定样品的荧光强度，与氨基酸标样对照(消除试剂空白荧光值)，求出样品氨基酸含量。

4)说明及注意事项

①本法在0～0.2mol/L酪氨酸范围内呈良好的线性关系。

②荧光物质的稳定性: 从保温完毕算起，相对荧光值在180min内平均减少2%左右。

③对羟基苯乙胺的存在对荧光光度测定存在干扰，色氨酸、3-(2-氨乙基)吲哚、苯丙氨酸、5-羟色氨酸、5-羟吲哚乙酸具有轻微的荧光值。

5. 脯氨酸的测定

1)原理

在丙酮溶剂中，脯氨酸和吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，在一定条件下(包括p H、缓冲液浓度和吲哚醌浓度)，可以在其他氨基酸存在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。

2)试剂和材料

①p H3.9的柠檬酸盐缓冲液: 柠檬酸2.1g，用1mol/LNa OH溶液调p H为3.9，并加水定容至100m L。p H计检测(可用0.1mol/LHCl溶液调节)。

②0.75g/L吲哚醌丙酮溶液: 37.5mg吲哚醌溶解于50m L丙酮中，置棕色瓶中贮存于冰箱中。若退色则失效。

③水饱和酚溶液: 于分液漏斗内加入苯酚及水，剧烈摇动后，放置过夜分层，取下层酚溶液。

3)分析步骤

①称取蛋白质样品5mg，加6mol/LHCl溶液2m L，封管后于140℃水解4h。启封，加蒸馏水稀释至盐酸浓度达0.25mol/L。

②吸取一定量蛋白质酸水解液0.1～0.5m L(含脯氨酸0.5～5μg)于小烧杯内，75℃干燥至恒重。残留物加p H3.9柠檬酸缓冲液0.2m L，使残留物完全溶解后，加0.75g/L吲哚醌丙酮溶液0.25m L，混匀，于100℃烘箱内使溶剂蒸发0.5h左右。以下各步骤在避光条件下操作。先加0.5m L水饱和酚溶液，剧摇后，加1m L蒸馏水和2m L丙酮，混匀成均相溶液，立即于波长598nm的条件下，以试剂空白调零，测定样品的A598，与氨基酸标准对照，求出样品中脯氨酸的含量。

4)说明及注意事项

①要获得最佳的灵敏度及专一性，必须严格控制本法所规定的条件，即控制缓冲液浓度0.1mol/L，p H3.9，吲哚醌浓度0.75g/L。

②脯氨酸与吲哚醌形成的蓝色化合物见光不稳定，在一般实验室光照下，1h后吸光值下降26%，因此必须避光操作。