液质联用技术在系统法医药毒物分析中的应用

二、液质联用技术在系统法医药毒物分析中的应用

（一）液质联用技术与药毒物谱库建立

与目前毒物筛选分析“金标准”GC/MS技术不同，液质联用技术因其自身特点，而没有统一的标准图谱库。在进行大量分析物的筛选分析前，药毒物标准谱库的建立是每一毒物分析实验室必需的工作基础。HUMBERT等建立了基于500多个与中毒相关化合物的源内CID LC/MS谱库，所获谱库数据采用了6种不同锥电压正离子模式和6种负离子模式，所有化合物色谱分离在30 min内完成。因此，每个分析物均具有特定的保留时间（retention time，t_R）及多至12种的特征质谱图。该技术采用血清和尿液样本进行检测，与常规的液相色谱二极管阵列检测和免疫检测结果比较，评估结果良好。然而，对于不同厂商所制造的仪器，质谱图存在一定差异，因此这种基于不同技术的液质谱库也给实验室间的结果比对带来困难。这种差异成为液质谱库未能推广的主要障碍。JANSON等的研究表明，不同仪器间的质谱图差异主要在于相对离子强度，而不是质谱m/z离子。而对于MS/MS谱，采用标准化仪器参数时，不同品牌液质谱图的重现性很好。因此，他们得出结论，质谱/质谱谱库才真正适用于不同实验室间的比对。

（二）液相色谱串联质谱技术的应用

1．液相色谱三重四级质谱技术的应用液相色谱三重四级质谱一般采用多反应监测（SRM）分析。2003年，GERGOV等报道了血液中238种药物的定性筛选分析方法。样品经过两步液液萃取后，待检物采用分离C₁₈柱液相分离。对每一化合物的筛选识别，基于其1对母离子－子离子对及保留时间t_R。这一检测技术的分析灵敏度足以检测到80%的药品在血液中治疗浓度水平药物。2005年，国内沈敏等对血液和尿液样本进行液液萃取处理后，采用SRM模式，以目标化合物的保留时间和母离子－子离子对为指标进行筛选分析，建立了132种药毒物的LC－MS/MS系统分析检测技术，最低检出限低至0．1～10 μg/L，其中83%的化合物检出限≤1 μg/L。筛选目标分析物为预选定的常见毒药物，包括违禁药物阿片类、苯丙胺类、大麻酚类；杀虫剂有机磷类、氨基甲酸酯类；药物包括苯二氮类、抗抑郁药类、抗癫痫类、止哮喘类、解热镇痛类以及常见治疗药物等。该方法还考虑到筛选分析药毒物范围的可扩展性，选取目标物的一对母离子－子离子对，以确保筛选分析的高灵敏度，而在确证分析时，增加至两对母离子－子离子对，并以两对母离子－子离子对建立了谱库。

2．液相离子阱质谱技术的应用离子阱质谱采用了离子储存技术，选择任意母离子进行碰撞解离，扫描子离子，可实现二级或多级质谱（MS_n）的功能，利用计算机处理软件也可获得多反应监测（SRM）谱。2005年，MUELLER等针对301种目标化合物，采用线性离子阱技术，提出了1种新的SRM检测方法。该方法先对301种化合物进行初始“调查”扫描监测，设立了301种化合物的SRM阈值。如果任何SRM超过这个预先设定的阈值时，则立即切换到“增强母离子”（enhanced parent ion，EPI）的扫描模式。在3个不同的碰撞能量下（如20 eV，35 eV和50 eV），获得子离子及其质谱，然后在数据库中进行检索。这一方法已成功地应用于血液和尿液药毒物的法医鉴定。

最近，林栋梁等采用1种线性增加碰撞能量技术（linear ramping collision energy teehnique，俗称smartfrag）建立了800种治疗药物、违禁药物及其代谢物和内源性干扰物的液相离子阱串联质谱谱库，并建立了相应化合物在生物样本中的检测方法。其特点是：碰撞能量的线性增加可以使母离子完全被碰撞解离而无残留，而子离子碎片极为丰富，分布范围广泛，因此可以大大增强子离子信息，从而丰富分子的结构信息，使质谱确证的准确性得到提高。在不同碰撞电压下，氟硝西泮的子离子质谱图如图30－8所示。

该实验的样品处理采用了HCX固相萃取柱（美国International Sorbent Technology公司产品）制备法，1 mL血液或尿液用1 mL pH值6．0磷酸缓冲液调节pH值后，上清液过预先活化的HCX柱，分别用2 mL去离子水，0．01 mol/L HCl，2 mL甲醇洗涤后，用2 mL体积比为73∶25∶2的乙酸乙酯－甲醇－氨水混合溶剂洗脱药毒物，用50℃氮气吹干溶剂。1 mL血液和尿液样品也可采用液液萃取法，萃取试剂采用1 mL Varian toxi-tube A（含pH值9．0碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液，二氯甲烷－二氯乙烷－正庚烷－乙酸乙酯混合有机溶剂）漩涡振荡10 min，离心取上清液，用50℃氮气吹干，残渣用100 μL初始流动相溶解后分析。对于指甲和毛发样本经清洗后，可用0．1 mol/L HCl水解，再用toxi-tube A萃取后进行分析。

图30－8　不同碰撞能量下氟硝西泮的子离子质谱图

0．3～2．0 ramping（A），0．5 V（B），1．0 V（C），1．5 V（D），2．0 V（E）

为实现高速分离，该方法采用了美国Agilent公司产品1．8 μm粒径ZORBAX SB－Aq 150 mm×2．1 mm×3．5 μm微柱进行液相分离，流动相的使用梯度洗脱法，流动相组成为流速0．32 mL/min的体积分数为0．1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），初始梯度组成（A/B 90∶1，V/V）保持1．5 min，然后在8．5 min内降低至0%A，分离温度为50℃。质谱ESI毛细管电压为3 500 V，用正离子模式电离。Smartfrag碰撞电压范围为0．3～3 V。在该分析体系下，通过保留时间和子离子质谱定性，对800种药物在15 min内可完成检测。其中，30种苯二氮类镇静催眠药物及24种违禁药物的LC－MS/MS数据库信息如表30－1和表30－2所示。

表30－1　30种苯二氮类镇静催眠药物及代谢物检出限与LC－MS/MS数据库自动搜索信息

注：⁹Not detected；LCD：limit of detection．

表30－2　24种吗啡类药物及代谢物检出限与LC－MS/MS数据库自动搜索信息

注：^aglu：葡糖苷酸．^bND：未检出

采用这一检测技术，作者对12例尸体样本及许多活体样本进行了系统毒物分析，结果发现，这一体系可广泛用于鸦片类、安非它明类、镇静催眠药、农药及一般常见药物的快速、高效分离筛选和确认分析，在待测药物保留时间范围内未见明显的干扰物存在，具有极佳的专一性。较之GC/MS，其最低检测限极低，对6－Acetylmorphine和Acetylcodeine的检测具有更高的灵敏度。与常规的2种检测法（荧光免疫偏振法和GC/MS）相比，其检出效率大幅提高，药物检验准确度也得到大幅提升。

（潘爱华）

参　考　文　献

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