组织工程真皮替代物主要产品的制备

一、制备组织工程真皮的基本要求

（一）厚度要求

真皮替代物的厚度应为0．3～0．4mm，以便于移植后表层能通过皮床的体液获得生存及生长必需的营养。

（二）孔径要求

海绵类和合成的人工真皮孔径应控制在50～150μm，这样才能保证非炎性结缔组织和毛细血管顺利地长入，孔径太小将不利于真皮重建。另外，材料的成孔率和孔之间的交通率也对人工真皮的性能有着重要影响。

（三）对接种真皮细胞的要求

相同的性别、年龄及出自同一解剖部位的Fb有助于降低终端产品的差异程度。

二、Dermagraft

它由美国Advanced Tissue Sciences公司制造，是将新生儿包皮第8代Fb接种在聚乳酸多聚体（PLA）三维支架上，通过三维培养生产出来的。Fb分泌由生长因子和基质蛋白组成的混合物，与支架材料一起形成具有活性的真皮组织。Dermagraft的产业化是通过封闭性生物反应器系统来完成的。这种生物反应器的设计采用了EVA容器，以便产品的无菌化、Fb的接种、组织的生长、冷冻、运输和存储，并且避免了产品的重新包装。大批量生物反应器系统的设计生产能力是每批可超过1 000块Dermagraft。生产的主要过程是：将Fb植入固定在EVA袋中的5．12cm×7．68cm的PLA膜上，旋转袋子以提高细胞种植的均匀性，然后添加含小牛血清、谷氨酰胺、维生素C和非必需氨基酸的DMEM培养基（生长培养基）进行培养，并定期更换培养基。组织在静止条件下生长，通过在封闭系统中的蠕动泵来更换培养基，培养基样本常规进行pH和葡萄糖利用情况检测，以预测组织收获的准确时间。在收获组织时，吸尽原有培养基，更换为含10%二甲基亚砜的低温保藏液。在－70℃条件下可以船运。

由于其半透明，使用时可以比对伤口，用无菌手术剪将移植物精确裁切为创面形状及大小，从EVA包装中取出后置入创面床，不缝合、以敷料包扎固定，确保Dermagraft不移动，并在创面愈合过程中保持潮湿。

三、无细胞真皮基质

也称去表皮的死真皮，是全厚皮肤（源于尸体皮、异种皮）经处理去除表皮和真皮细胞的真皮基质，有正常的胶原及结构，有完整的基底膜，抗原性低。含有胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖和生长因子等成分。它们支持创面床血管长入、周围真皮和皮下组织的细胞定植、创面边缘的KC快速迁移。因此，能提供真皮替代和促进创面覆盖。研究表明，使用无细胞真皮基质可促进慢性溃疡和创伤皮肤伤口的愈合，移植成功率高。但制备真皮基质的方法不同，所保留的细胞外基质和细胞决定簇（cellular determinants）的量也不同，移植效果也有差别。报道的主要方法有1mol／L高渗盐水室温过夜或2．5U／ml分离酶或0．25%胰酶4℃作用24～48h脱细胞；之后0．5%Triton X－100或0．5%～1%SDS振荡洗涤1～3h去除细胞碎片，冻干制成。Triton对制备的真皮基质结构影响小，SDS虽然效率高，但往往导致结构的破坏和有效成分的丢失。动物实验表明，用胰蛋白酶消化去除表皮因为破坏了基底膜板素和Ⅳ型胶原将无支持KC黏附和分化的能力；而真皮乳头层保留了完整基底膜带和网状层植入了Fb的无细胞真皮基质才是KC黏附、生长、层化和分化的良好基质。因而推崇用高渗盐水或分离酶脱细胞。但有报道先冷冻保存皮肤，解冻后0．25%胰酶37℃2h既可去除所有完整细胞，又可保存基底膜结构。美国得克萨斯Life Cell公司生产的经过特殊程序处理的无细胞同种异体人真皮基质商品名为AlloDerm，1992年获得FAD市场许可。

四、Integra

Burke和Yannas等首创，以前曾叫artificial skin，现由美国Integra Life Sciences公司制造。由戊二醛交联牛Ⅰ型胶原与鲨鱼6－硫酸软骨素构成“真皮”，有70～200μm的微孔，“表皮”为约厚100μm的硅橡胶薄膜。1996年，获得FDA市场许可。Integra这种多孔结构有利于纤维血管从接受移植者创面长入。