排斥反应相关细胞因子

（一）细胞因子

是指主要由免疫细胞分泌的、能调节细胞功能的小分子肽。在免疫应答过程中，细胞因子对于细胞间相互作用、细胞的生长和分化有着重要的调节作用，成为当今基础研究和临床免疫学研究的一个十分活跃的领域。器官移植中，同种异体抗原能引起受者强烈的免疫应答，以下为近年来研究报道参与了器官移植免疫应答的部分细胞因子。

1．白细胞介素－2（IL－2）　由T细胞和NK细胞产生的15．5kU糖蛋白，在机体的免疫应答中起重要作用，IL－2的分子量是15～17．2kU或19～23kU，人IL－2含133个氨基酸残基，等电点为PI　6．8～8．2，对热比较敏感，56℃1h，37℃12h或70℃15min处理仍保留活性，4℃可保存1年，其活性在pH　2～9范围内保持稳定，对蛋白酶敏感，对DNA酶、RNA酶和神经氨酸酶不敏感。IL－2仅仅作用于有限的免疫细胞，包括T细胞、大颗粒淋巴细胞、单核细胞、B细胞、和少突神经胶质细胞，促进细胞增殖和分泌细胞因子，其最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖和分化。IL－2对T细胞的作用还包括增强CTL的细胞毒活性，增加细胞间的接触和诱导细胞分泌细胞因子（IFN－γ，IL－4，TNF和CSF等）；IL－2还可能参与自身耐受和自身免疫的机制，能诱导NK细胞的增殖，增强其活性，高剂量的IL－2也能引起单核巨噬细胞的增殖和分化，并加强单核巨噬细胞杀肿瘤细胞的作用。在体内，IL－2有抗肿瘤、抗微生物感染、引起移植排斥和自身免疫以及免疫调节等作用。可溶性IL－2作为免疫抑制药，对白血病、移植排斥和自身免疫病可能有治疗作用。

2．白细胞介素－4（IL－4）　由辅助T细胞（Th细胞）产生的细胞因子，主要作用于B细胞，能增强IgE介导的体液免疫和杀伤细胞的杀伤能力。蛋白分子量为15ku，等电点为10．4～10．5，对多种蛋白酶敏感，在4℃中可保存3个月以上，在室温可保存1个月。56℃10min不灭活，在pH2～10中保持稳定。IL－4属于Th2细胞产生的特征性细胞因子，能抑制Th1细胞产生细胞因子的能力和其他辅助功能，IL－4对免疫应答的影响主要是抑制细胞免疫，促进体液免疫（特别是IgE反应，增强特异性和非特异性的杀伤功能。IL－4的主要作用是针对B细胞的，是IgE的特异性诱导剂，能维持抗原活化B细胞的生长的扩增。IL－4还能在一定条件下维持胸腺细胞和活化T细胞生长。诱导活化T细胞表达CD23，还可诱导NK细胞增殖。

3．白细胞介素－10（IL－10）　可由多种细胞产生。某些CD4＋T细胞克隆、来自AIDS病人B细胞系、EBV感染的淋巴母细胞、活化单核细胞、外周血T细胞均可产生IL－10。其生物学活性包括可抑制单核／巨噬细胞MHC－Ⅱ类分子、辅助刺激分子表达和细胞因子产生，抑制其抗原呈递作用，从而间接降低T细胞增殖水平和细胞因子的产生。可抑制Th细胞的克隆增殖。

4．白细胞介素－17（IL－17）　最初称为CTLA8。人IL－17基因位于2号染色体，有155个氨基酸残基，糖基化后的分子质量为20ku，人外周血活化CD4＋T细胞和某些T细胞可产生IL－17。B细胞和静止T细胞不表达IL－17。IL－17可激活成纤维细胞，并诱导其分泌IL－6，IL－8，GM－CSF，PGE2和ICAM－1的表达。促进T细胞的增殖，而且内源性IL－17可能在T细胞的激活过程中起着调节作用。

5．TGF－β　TGF－β基因位于染色体19q13．1、1q41、14q23上，机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF－β，活化后T细胞或B细胞产生TGF－β水平比静止细胞明显增高。在临床上，由于TGF－β对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，因此，TGF－β及TGF－β受体及其介导细胞途径中信号分子的缺陷可能与某些肿瘤的发生相关。新近研究表明TGF－β在治疗伤口愈合、促进软骨和骨修复以及防治移植排斥反应方面有着潜在的应用前景。

6．穿孔素（perforin）　又称孔蛋白（poreforming　protein，PFP），由534个氨基酸组成的糖蛋白，与补体成分C9有同源性。穿孔素主要表达于CD8＋T细胞、NK细胞、和δγT细胞。

（二）细胞因子的检测方法

细胞因子的主要检测方法为免疫学方法，其基本原理是细胞因子或受体与相应的特异性抗体结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子的或受体的水平。大多采用酶联免疫吸附试验（enzyme－linked　immunosorbent，ELISA）和放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）、流式细胞术。主要介绍流式细胞术测定胞内细胞因子

1．原理　机体内许多细胞特别是淋巴细胞，在受到外界刺激后会分泌细胞因子，来调节自身或其他细胞的功能。检测胞内细胞因子的含量，可以部分反映细胞的功能。由于在生理条件下，单个细胞内细胞因子含量较少，不容易被流式细胞仪检测到，所以常给与一定量的多克隆刺激剂（如PMA），同时阻断细胞因子向胞外分泌（如brefel－din　A和monensin），这样可以检测微量的胞内细胞因子。

2．方法

（1）收集细胞，用PBS洗一遍，计数，用完全培养基调至5× 106细胞／ml，取1ml加入24孔板中。

（2）每空加入1μl　1mg／ml的ionomycin（终浓度为1μg／ml）和25μl　2μg／ml的PMA（终浓度为50ng／ml），同时加入1μl 10μg／ml的monensin（终浓度为10ng／ml）或者10μl　1mg／ml brefeldin　A（终浓度为10μg／ml），37℃，5%CO2孵育4h。

PMA为多克隆细胞刺激剂，ionomycin为Ca2＋通道活化剂，它们可以活化绝大部分淋巴细胞，以增强细胞因子的分泌。monensin或brefeldin　A为蛋白质转运抑制剂，可以抑制细胞因子被释放到细胞外。细胞在4h的强刺激后，可能会发生凋亡，核内DNA释放，导致细胞黏结成团，影响检测结果，所以可以在收集细胞前，每孔加一定量的DNA酶，37℃，5%CO2孵育5～10min。

（3）收集细胞，用PBS洗2次，用100μl　PBS重悬细胞，加入适量Fc受体阻断剂，4℃避光放置30min。

（4）加入适量的特异性表面标记荧光抗体或独特性对照抗体，4℃避光放置30min。

（5）用PBS洗2遍，用100μl固定液重悬细胞，常温避光放置20min。固定液的有效成分主要为0．5%～4%的多聚甲醛。

（6）用PBS洗2遍，加200μl穿膜液重悬细胞和适量Fc受体阻断剂，常温避光放置30min。穿膜液的有效成分主要为0．1%的皂素。固定液和穿膜液都有商用试剂，可直接购买。

（7）加入适量荧光标记的胞内细胞因子抗体或独特性对照抗体，常温避光孵育1h。

（8）用PBS洗2遍，用300μl　PBS重悬细胞，上机检测。

3．预期结果　如图所示，这是检测外周血淋巴细胞中IFN－r和IL－4的结果，在正常情况下，IFN－r分泌量较多（比例15%～40%），而IL－4则较少（比例1%～5%）。

4．注意事项

（1）穿膜液可能会使细胞表面抗原脱落，或者使已经标记的抗体脱落，或者使抗体上的荧光发生淬灭，从而导致细胞表面的荧光量下降。

（2）PMA和ionomycin的刺激是必需的，因为在自然状况下，单个细胞本身分泌的细胞因子的量就很少，通常超出流式细胞仪的检测下限。此外，brefeldin　A和monensin等蛋白质转运抑制剂也是必需的，因为细胞因子在胞浆内合成后很快会分泌到细胞外，会导致胞内细胞因子的含量下降。brefeldin　A和monensin对胞内细胞因子的检测几乎差不多，个别有少许差异，推荐使用monensin，因为试验成本相对低些。

（以Th1和Th2的检测为例）