浓度监测技术

环孢素是一种从真菌中得到的11个氨基酸组成的环状多肽，是一种强效免疫抑制药，广泛用于防治肝、肾、胰、心、肺等实质性器官和骨髓等同种异体移植时的排斥反应，提高患者的生存率和移植物的存活率。但由于CsA的生物利用度和药动学参数的个体差异较大，特别是在肾移植病人中，CsA的生物利用度可相差10～20倍。其治疗窗狭窄，有效阈值窄。剂量过大，血药浓度过高时，易产生难以与排异反应相区分的肝肾毒性；剂量不足，血药浓度过低时会影响疗效，出现排异反应，可导致移植肾失活。而且CsA血药浓度水平易受性别、年龄、肥胖、肝肾功能、胃肠功能、药物相互作用以及饮食等众多因素的影响。因此在移植术后进行CsA血药浓度监测并调整其浓度在有效范围对指导临床合理用药具有重要的临床意义。

目前，国内外最常用的测定方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、高效液相质谱联用法（HPLC－MS）、高效毛细管电泳法（HPCE）、受体结合法（RBA）、荧光偏振免疫法（FPIA）、放射免疫法（RIA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、克隆酶供体免疫测定法（CEDI）等。其中以HPLC法和FPIA法应用最为广泛。

1．HPLC法　HPLC法是20世纪70年代发展起来的一种测定血药浓度的方法。可采用合适的色谱柱，对CsA和其17或18种代谢物进行分离和鉴定。HPLC法不但能测定CsA母药浓度而不受其代谢物的干扰，结果准确可靠，灵敏度高，精密度好，杂物少，回收率大，而且对于分析环孢素类化合物中其他的免疫抑制药提供了帮助。主要有固－液提取和液－液多步提取法，具有专属性强、灵敏度高、线性范围广等优点，是评价其他方法的参考方法。此法已经成功应用于肾移植患者的标本测定，为临床合理用药提供了理论依据。HPLC法样品处理简单，灵敏度高，准确性好，价格相对合理，对样本量要求不高，适合于中小医院。但这种方法也有其缺点。由于CsA缺乏发色团和可供制备衍生物的官能团，监测必须用210nm波长的短波，而许多内源性杂质在该波长处也有吸收，故在测定全血中CsA浓度时需对样品进行溶血预处理以去除这些干扰物质，即一般采用氢氧化钠、氟化钠（NaF）或十二烷基硫酸钠破坏红细胞，游离出CsA，以保证有机溶剂对CsA的萃取率。操作发现：增加NaF等溶剂的用量可以提高萃取回收率，但杂质含量也会增加。另一缺点是分析柱温需达到70～75℃才能得到合适的分离度，在此温度下分析柱通常仅能维持2～4周。另外，样品的前处理复杂、费时，回收率低，不适于批量样品测定。且需特殊的技术和昂贵的设备，以及高素质的专业技师。

2．HPLC－MS法　这种方法选用质谱检测器，可利用任一质荷比或多个质荷比的离子信号进行物质的浓度检测。利用电喷雾电离源，选择性多离子监测质荷比为1　203的CsA分子离子峰及质荷比为1　217的内标CsD分子离子峰。具有用血量少，样品处理过程简便，节省溶剂用量及监测时间等优点。而且高效液相和质谱联用后分辨性能高，灵敏度高，分析速度快，是一种高特异性的检测方法。

3．HPCE法　HPCE法是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的淌度和分配的差异而实现分离的一种液相分离技术。其具有分析速度快、分离效率高、操作模式多、应用范围广、选择性强、能通过添加各种试剂进行非离子性样品分离的优点。应用毛细管胶束电动电泳方法定量检测全血中CsA的方法灵敏、特异、稳定，尤其是能排除部分CsA代谢产物对现有免疫学测定方法的干扰，使临床更好地监测患者的CsA血药浓度。而且HPCE多采用缓冲液，有机溶剂使用少，具有经济、环保的优点，体现了广阔的应用前景。

4．RBA法　RBA法应用于临床CsA全血浓度的测定是基于有些活性药物通过直接与受体反应产生疗效，其疗效强弱与药物和受体结合位点的亲和力大小有关的理论。受体结合法不仅能测出CsA原型药物，同时还可测出其代谢产物，能提供药动学和药效学之间有意义的联系，有望改善CsA治疗的监测。该方法具有快速、简便、特异性强、敏感性好、稳定可靠、经济性好等优点。李芳秋等建立了特异性亲环孢素结合法测定CsA血药浓度。这一方法的建立，也为CsA血药浓度监测试剂的国产化打下基础。

5．FPIA法　FPIA法是根据荧光偏振原理，即基于待测物CsA和联接了荧光部分的CsA示踪物（荧光体）与特定抗体上有限受体结合位点的竞争性结合建立的一种免疫分析方法。当待测样品中存在能与抗体结合的药物时，该药物将争夺荧光体－抗体复合物中的抗体并释放出荧光体，引起偏振度的下降，根据下降的程度即可确定出样品中CsA的浓度。有非特异性多克隆抗体（PCFPIA）和特异性单克隆抗体（MAFPIA）两种试剂，可反映CsA原型在体内的水平。它克服了放射免疫法存在的环境污染和辐射伤害的缺点，其具有自动化程度高、样品需求量少、线性关系好、重现性好、选择性好、灵敏性好、专属性强、速度快、准确、省时等优点。PCFPIA反映的是CsA原型与主要代谢物的总浓度，体现CsA在体内的综合作用。但随移植术后时间的推移，CsA代谢产物浓度增加易造成临床误差。MAFPIA法操作简便、快速省时、灵敏度高、结果准确、稳定性好，是目前国内外器官移植中心监测CsA血药浓度选择的主要方法。

但非特异FPIA法的缺点是能与CsA的代谢物发生交叉反应，特异性不好，测定结果往往明显高于放射免疫法和高效液相色谱法，也是由于分析中的抗原不能区分原型与代谢产物所致。并且使用的试剂盒价格昂贵，需要特殊设备，操作复杂，有效期短。若检测样品少，则易造成不必要的浪费。因此，该法更适用于批量检测。

6．RIA法　RIA法是1959年由Berson和Yalow提出的通过比活度高的示踪物（如3　H或125I），观察抗原与抗体结合反应产物来定量微量物质的一种分析方法。应用同位素标记物和被测物（或标准品）发生可逆性竞争结合反应检测特异结合试剂（特异性抗体）的方法，最终形成的放射性复合物与被测物的含量呈逆相关。包括非特异性多克隆抗体法（NSRIA）和特异性单克隆抗体法（SRIA），其优点是灵敏度高、特异性强、准确、样品用量少、更新时间迅速、萃取方法简单、在临床实验室应用广泛、易规范化和自动化、并适于大批量样品测定。其中NSRIA法所需样品体积小（约10μl），最低检测浓度可达20ng／ml。

但缺点是其对于母体药物无特异性，应用于RIA法的抗体与CsA的9种代谢物具有不同程度的交叉反应。因此，这种方法不能区分环孢素母体与其复杂的代谢物，而且不同的代谢物的消除率随母药的动力学参数改变而改变。这种代谢物的交叉反应导致CsA在全血中的检测浓度一般高于HPLC法2～3倍或更高。但SRIA法对原型药有很好的专一性，其测定结果与HPLC法完全一致，并不随给药时间和给药途径而变化，对临床监测更有价值。但因测定试剂的半衰期短，每次测定都要绘制标准曲线，测定单个样品的成本较高。而且其需要特殊检测设备，可能使操作者受到放射性危害，试剂盒的使用期限也受标记的放射性物质的半衰期的限制。且存在放射性污染和放射性废物处理难等缺点，故近年临床应用逐步减少。

7．ELISA法　ELISA法是1971年由Engrall发明的，他用酶代替荧光体标记抗原或抗体，利用该酶的底物处理抗原－抗体复合物时显色的程度来确定样品中CsA的浓度。该法兼具荧光免疫及放射免疫的优点并克服了一些缺点，除具有灵敏度高、特异性强的优点外，还具有试剂较稳定、有效期较长、无放射性、测定后的反应液无需特别处理、容易实现自动化、不需特殊设备、操作简便、快速等特点。对已有自动生化分析仪的实验室很容易开展。

8．CEDI法　这是近年发展起来运用基因工程的均相酶免疫测定法。其原理为标本中的CsA和ED（酶供体）－CsA与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED－CsA与抗体结合后由于空间位阻失去与EA（酶受体）自然重组的能力，与标本中CsA浓度成正比的酶活力降低，通过测定酶活力而计算血CsA浓度。此法线性范围为50～1　800ng／ml，精密度好，灵敏度高。与FPIA法相比，线性范围更广，不需要专门分析设备，尤其无需离心、抽提等处理，节省操作时间，检测成本低。