桔梗花粉活力形成及田间老化对结实能力的影响

花粉活力是指影响花粉萌发生长以及最终完成受精的全部潜在能力，所含的内容较为广泛，包括花粉内部生理生化性能、花粉萌发特性、花粉管生长、受精活力、生命力、贮藏性能、花粉寿命等。近年国内外对花粉活力方面研究有较多报道，张彬等研究了田间条件下高温对水稻花粉在柱头上的萌发生长、受精活力以及结实特性的影响;孙春青等研究了菊花花粉活力与结实率间的关系;姬慧娟等人认为多枝柽柳花粉散出时活力最高，24 h后活力迅速下降，且不同生境、不同花期开放的花朵花粉活力寿命相同;曾凡锁等将抗虫基因转入白桦基因组中，由于外源基因在花粉中的表达，导致转基因植株花粉活力明显降低。但关于桔梗花粉活力的报道，仅见魏建和等采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定了桔梗花粉寿命;刘自刚等对桔梗花粉贮藏特性进行了研究。但采用TTC染色法很难全面反映桔梗花粉实际活力状况，为此采用桔梗花粉离体萌发和花粉管测定法，对桔梗花粉活力的形成及开花散粉后花粉在田间状态下活力变化动态进行了研究，以期为桔梗花粉保存、人工杂交体系的建立等提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

供试材料桔梗花粉为2008年7月中旬采自陕西商洛香菊制药公司药用植物园二年生桔梗群体。

1.2　方法

1.2.1　试验处理

选取无病虫为害的发育健壮植株，盛花期于上午7:00～8:00，分别采摘当天开放花朵和花前1d、2d、3d、5d、7d的幼蕾5朵，带回实验室备用;同时选取当天刚开放的花朵150朵套袋，并挂牌标记，注明日期和时间，之后分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、27 h、30 h、33 h、48 h、51 h、54 h、57 h、73 h、75 h、78 h、81 h、96 h、120 h、144 h、168 h和192 h采摘标记花朵5朵带回实验室测定花粉萌发率和花粉管长度。

1.2.2　花粉离体萌发方法

桔梗花粉离体萌发选用筛选的液体培养基，培养剂配方为:ME3+BK+150g·L-1 PEG4000+100g·L-1蔗糖。将花粉培养液滴入凹形载玻片凹槽中，将采集的相同处理的桔梗花粉混合均匀后，用毛笔蘸取适量匀撒在培养基上，置于底部垫有双层湿润滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入恒温培养箱内30℃培养，1.5 h后进行花粉萌发率统计和花粉长度测量。

1.2.3　培养温度和培养时间筛选

在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃5种不同温度条件下，用ME3+BK 150g·L-1 PEG6000+100g·L-1蔗糖作为花粉萌发培养基，分别培养15min、30min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、7.5 h后观察花粉萌发和花粉管生长情况，筛选最适培养温度和培养时间。

1.2.4　花粉萌发和花粉管长度检测

以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复5次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率;同时用显微测微尺测量花粉管长度(μm)，每视野随机测量10个花粉，每处理共测150个花粉管长度，计算其平均值。

1.2.5　花粉授粉结实测定

于盛花期选择健壮单株花蕾，去雄、套袋并挂牌标记，待柱头开裂成熟后，分别授以当天新鲜花粉、花后1d、2d、3d和4d不同活力的花粉，同一活力花粉授50个柱头，授粉后套袋防止串粉，并挂牌标记，10d后去除纸袋，成熟时考察结果数、饱满粒数和瘪粒数，并计算结果率和结籽率。

结果率=获得的果数/授粉花朵数×100%

结籽率=饱满粒数/(平均单花胚珠数×授粉花朵数)×100%

2　结果与分析

2.1　温度对桔梗花粉萌发生长的影响

以ME3+BK+150g·L-1 PEG4000+100g·L-1蔗糖为培养基，在不同温度条件下桔梗花粉萌发和花粉管生长情况见表2-5-1。

表2-5-1　培养温度对花粉萌发生长的影响

可以看出温度对桔梗花粉萌发生长具有显著影响，在20～30℃范围，萌发率和花粉管长度随温度的升高而增大，当温度进一步升高时，花粉萌发率有所下降，生长也减缓;表明桔梗花粉萌发的最适培养温度为30℃，在此温度下培养桔梗花粉其萌发率和花粉管长度达到最大值分别为99.7%和654.6μm。

2.2　桔梗花粉管生长过程

在ME3+BK+150g·L-1 PEG4000+100g·L-1蔗糖培养基上，30℃光培养，桔梗花粉萌发生长情况见图2-5-1，可见在开始培养的1 h，随培养时间的延长桔梗花粉萌发率迅速提高，1.5 h达到最大，之后萌发率不再增加;花粉管长度在初始培养的1.5 h快速生长，之后花粉管生长逐渐趋于停顿。桔梗花粉10min开始萌动，15min花粉管从花粉孔中突出，20min花粉管长度已超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长，1 h多数有活力花粉均已萌发，4 h花粉管相互交织在一起，花粉管顶端开始膨大，5 h许多花粉管顶端破裂，内容物放出。

图2-5-1　培养时间对花粉萌发率的影响

2.3　蕾期桔梗花粉活力的变化

不同植物花粉粒活力达到最高的时期不同，许多植物开花前后一段时间花粉活力达到最高，桔梗开花前活力形成见表2-5-2。随着开花的临近，桔梗花粉萌发率和花粉管长度均逐渐升高，花刚开放时，花粉活力还未达到最高，花粉萌发率和花粉管长度仅为27.8%和343.1μm。

表2-5-2　开花前桔梗花粉活力变化

2.4　开花后桔梗花粉活力的变化

开花后桔梗花粉活力变化情况见图2-5-2，从图2-5-2中可以看出，随着花后时间的延长，桔梗花粉萌发率和花粉管长度变化趋势相同，即开花当时桔梗花粉萌发率和花粉管长度均较低，随着花粉粒继续发育，花粉活力迅速升高，到开花后6 h达到最大，花粉萌发率和花粉管长度分别为92.2%和602.9μm，之后开始下降，到花后192 h时，花粉萌发率降到仅为7.6%，花粉管长度为55.9μm。

图2-5-2　培养时间对花粉萌发率的影响

从图中还可以看出，在花后6～120 h，花粉萌发率下降速度较为缓慢，到花后120 h时，萌发率仍较高为63.1%，之后下降速度明显加快。

2.5　花后时间对桔梗花粉授粉结实性的影响

开花后时间对桔梗花粉授粉结实性的影响见表2-5-3，可以看出开花当天花粉授粉结果率、结籽率最高，之后随着花后天数的增加，结果率和结籽率均迅速下降，到花后3d时，结籽率已降为0，表明桔梗在开花后3d花粉已失去了授粉结实的能力，此时花粉萌发率仍较高为72.3%，而花粉管长度287.0μm，仅为开花当天花粉管长度的47.6%，这说明花后3d花粉失去授粉结实能力的原因可能是由于花粉管生长缓慢，花粉管长度较短，难以到达胚囊而完成受精作用造成的。

表2-5-3　开花后时间对花粉授粉结实性的影响

图2-5-3　花粉管生长情况

1.萌发的花粉;2.生长40min的花粉管;3.生长1 h的花粉管

3　讨论

植物花粉活力的形成及保持特性，除受基因控制外，还受到环境因子的修饰。茄花粉夏季只能存活1d，在冬季则可维持3d;枣的花粉活力可维持数月至1年;刺五加长花丝植株的花粉活力比中花丝植株高，花粉活力及其下降快慢随生境不同而有所差异;锦带花的花粉活力在开花之初较高，且能持续约3d，之后迅速下降;多枝柽柳的花粉活力在不同生境条件下俱可保持48 h。魏建和等采用TTC染色法测定了桔梗花粉活力后认为，田间条件下桔梗花粉活力可保持2～3d。本研究中，采用人工授粉和花粉离体萌发法测定了桔梗花粉活力，结果表明，桔梗花粉授粉结实能力在田间条件下可保持2d，第3日已完全失去授粉结实能力;而花粉离体萌发和花粉管长度测定结果显示，花后3d花粉萌发率为72.3%，表明此时仍有多数花粉具有生命力，能够萌发并长出花粉管，但花粉管生长速度和长度明显降低，仅为开花当天花粉管长度的47.6%。据此我们认为造成花后3d花粉丧失授粉结实能力的原因为:花粉管生长缓慢，造成花粉管长度较短难以到达胚囊完成受精作用，最终导致开花后3d花粉结实能力的丧失。另外，在田间条件下，花后5d仍有63.1%花粉具有萌发生长能力，因此我们认为桔梗花粉寿命在5d以上，这一结果与魏建和等的研究相差较大，其原因可能是实验地点气候环境、测定方法等不同造成的。

随着小孢子发育花粉结构逐渐完善，内部生理特性逐步改良，其活力也不断提高，当花粉粒完全成熟时各种性能处于最佳状态，其活力也达到最高，之后随着其在环境中暴露时间的延长，花粉所含营养物质不断被消耗，花粉粒逐渐老化，性能逐渐劣变，其活力也逐渐降低直至最终失去活力。不同植物花粉粒活力达到最高的时期不同，有些植物开花前后一段时间花粉活力达到最高。桔梗在开花当时，花粉萌发率较低仅为27.8%，随后花粉粒继续发育，到花后6h其活力达到最高。桔梗花粉发育的这一特征是其长期进化过程中形成的与访花昆虫行为相适应的一种传粉机制，桔梗单花开放时间主要集中在清晨5:00～8:00，访花昆虫频繁活动时间为9:00～14:00，这一时段也正是桔梗花粉活力最高的时期，高活力花粉即可被访花昆虫进行高效传播，增加传粉结实几率。

4　结论

采用花粉离体萌发和花粉管测定法对桔梗开花前花粉和花后花粉活力在田间条件下的动态变化规律进行了研究，采用人工授粉的方法将花后不同时间的花粉给成熟柱头授粉，研究不同花粉授粉结实能力的变化。结果表明:桔梗花粉离体萌发的最适温度为30℃，培养1.5 h是花粉管测定的最佳时间;桔梗蕾期和开花当时花粉离体萌发率和花粉管长度仍较低，开花后花粉继续发育，活力逐渐提高，到花后6 h达到最高，其萌发率和花粉管长度分别为92.2%和602.9μm，之后活力开始逐渐下降;花后120 h仍有63.1%的桔梗花粉具有萌发能力，而花粉管长度只有287.0μm，仅为花后6 h花粉管长度的47.6%，开花120 h后花粉活力下降速度明显加快。对开花后花粉授粉结实能力的研究表明:开花当天花粉结果率、结籽率最高，之后随着花后天数的增加，结果率和结籽率均迅速下降，开花后3d的花粉，结籽率已降为0，已完全丧失授粉结实能力。可见在田间条件下，桔梗花粉寿命可保持5d以上，而授粉结实能力只有2d左右;花粉管生长缓慢长度变短是导致花后3d花粉丧失授粉结实能力的主要原因。