不同贮藏方式对桔梗种子活力及生理特性的影响

目前制约桔梗生产发展的一个重要因素是其种源问题，据刘自刚等2010年3月对9份市售种子的发芽率检测结果，仅4份发芽率在60%～75%，2份在50%左右，1份23%，1份已完全丧失发芽率。桔梗授粉后种子约经历60d的生长发育即可达到形态和生理完熟阶段，此时桔梗种子活力最高，其发芽率可达95%以上，之后随着种子贮藏时间的延长，活力逐渐下降，直至完全丧失活力。目前市售桔梗种子活力普遍较低，桔梗种子秋季成熟收获(9月中旬)至翌年春季播种(3月下旬)，种子需要一段时间的贮藏期，贮藏条件对种子活力变化有重要影响，加之桔梗种子较为细小，千粒重仅为1.0g，可供维持生活力的干物质积累相当有限，种子活力本来就较容易丧失，贮藏期间如条件选择不当，就会引起发芽率大幅降低。

另外，桔梗作为一种中药材其种植面积受市场波动的影响很大，种子是桔梗的主要繁殖体，而桔梗种子的生产周期较长，一般需要两年，这就使桔梗种源的生产很难适应波动的市场需求，常常造成桔梗种源的极度短缺或大量过剩，增加了桔梗生产和种子经营的潜在风险。桔梗是异花授粉植物，并具有自交不亲和特性(雌雄异熟)，其种质资源和育种材料的更新，因需要隔离和人工辅助授粉，资源更新成本很高。如能通过研究选择适宜的贮藏环境而延长桔梗种子贮藏寿命，则可减少繁殖更新次数，并可调节种源市场供应在年际间的稳定性，而降低资源材料保存成本和种子经营风险。

目前，贮藏对种子活力影响的研究主要集中在作物方面，对桔梗种子活力的形成特征及其保持方法的研究已见少量报道。研究认为，桔梗种子粒重和发芽能力随着花后发育时间的增加而逐渐升高，到55d时两项指标均达到最高值，种子发育期间粒重的变化很少受气象因子的影响，而主要与其遗传特性有关;在桔梗种子成熟过程中存在明显的生理后熟特性，生理后熟期较短，一般在种子发育的第55日至61日内完成，完成生理后熟的桔梗种子发芽率显著提高。

桔梗种子成熟收获后如超干处理(2.6%～4.7%)和低温(0～5℃)贮藏，种子寿命明显延长，并发现降低种子含水量可达到与低温贮藏等同的效果。但这些报道只有贮藏12个月时种子活力变化情况，而均未涉及如干燥器贮藏、干燥剂包埋贮藏等其他贮藏方式和温度梯度(4℃、-20℃、-50℃)对桔梗种子活力的影响，以及在更长时间(2年以上)贮藏进程中桔梗种子活力的动态变化。不同温度梯度下贮藏对桔梗种子活力影响的研究，可确定桔梗种子在不同温度下贮藏过程中的动态变换规律，对最佳贮藏温度的筛选和种子劣变机理的阐明具有重要意义。

干燥器和干燥剂包埋贮藏可保持和稳定干燥的贮藏环境，可避免因环境湿度变化引起种子含水量波动;同时这两种贮藏方式只需定期更换变色硅胶，是少量种子最为经济的贮藏方式。本试验研究了不同贮藏方式(干燥器贮藏、干燥剂包埋贮藏)和不同温度(4℃、-20℃、-50℃、常温)下桔梗种子在贮藏过程中其活力的动态变化规律，结果将在阐明桔梗种子活力变化规律、种子最佳贮藏条件筛选以及良种贮藏、育种材料和种质资源的保存等方面具有重要价值。

1　材料与方法

1.1　材料

供试桔梗种子为2007年9月下旬采自陕西商洛桔梗育种基地二年生栽培群体，种子采收晾晒后选取发育良好、整齐一致的饱满种子备用。供试桔梗种子原始特征性状为，发芽率96%，含水量6.3%，千粒重1.1g。

1.2　方法

1.2.1　种子贮藏方法

将供试桔梗种子分成6份，其中3份分别置于4℃、-20℃、-50℃冰箱中进行低温贮藏;1份装在种子纸袋中并置于干燥器内常温贮藏(干燥器贮藏);1份用脱脂纱布包裹后埋于装有变色硅胶的广口瓶中在常温下贮藏(超干贮藏)，瓶口用凡士林密封，种子量：变色硅胶量=1：10，贮藏过程中及时更换变色硅胶;1份装入种子纸袋中室内常温贮藏作为对照。每隔一段时间取上述不同方式贮藏的桔梗种子测定其发芽率、发芽势、发芽指数、种子浸出液电导率、POD活性和MDA含量，并结合发芽试验测定种子发霉率。

1.2.2　种子发芽试验

各处理桔梗种子分别取100粒，培养皿垫双层滤纸作为发芽床，25℃光培养，重复3次。胚根与种子等长为种子发芽标准，发芽结束后计算发芽率、发芽势和发芽指数。相关指标计算公式如下:种子发芽率(%)=n/N×100%;发芽势(%)=G7/N×100%;发芽指数=∑Gt/Dt;发霉率=S/N×100%。式中，n为发芽终期全部正常发芽的种子数，N为供试种子总数;Gt为t日发芽数，Dt为相应的天数，S为发芽结束后发霉种子数。

1.2.3　电导率测定

分别称取各处理后种子1g，去离子水冲洗种子表面，放入烧杯中，加50ml去离子水，25℃浸泡24 h，用DDS-11A型电导仪测定浸泡液的电导率。重复2次。

1.2.4　过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性测定

POD活性测定采用愈创木酚法，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法。

1.2.5　数据分析处理

利用SPSS软件对实验数据进行统计分析。不同贮藏方式、贮藏温度和不同贮藏时间的桔梗种子发芽率、发芽势、发芽指数、电导率、POD活性、MDA含量等指标采用双因子方差分析(Two-way ANOVA)，不同处理间差异显著性采用Duncan多重比较(Duncan'smultiplerange test)检验。

2　结果与分析

2.1　不同贮藏方式对桔梗种子发芽特性的影响

不同贮藏方式对桔梗种子原始活力的影响效果明显不同(表4-3-1)。相同原始活力的桔梗种子贮藏2个月后，低温(4℃、-20℃、-50℃)和干燥(干燥器贮藏、超干贮藏)条件下贮藏的桔梗种子发霉率除4℃贮藏与对照相同外，其余各处理均明显高于对照;而发芽率、发芽势和活力指数比对照(常温贮藏)明显下降，且下降幅度随温度降低有增大趋势，其中-50℃低温贮藏和超干贮藏的种子上述各发芽指标增加幅度均达极显著差异水平。表明不同贮藏方式处理对桔梗原始活力的影响效果不同，原始活力相同的桔梗种子置于低温和干燥条件下可引起其活力的部分丧失，且随贮藏条件趋向严酷(更低的贮藏温度和湿度)原始活力的丧失幅度越大。由贮藏处理引起的桔梗种子活力的部分丧失可在随后贮藏过程中逐渐得以恢复，贮藏6个月时发芽率恢复到贮藏前的活力水平，发芽势和发芽指数比贮藏前还略有升高。

之后随着贮藏时间的延长，不同方式贮藏的桔梗种子发芽指标基本呈先保持平稳后明显降低的总趋势，如常温贮藏的桔梗种子在贮藏6～20个月期间，随贮藏时间增加发芽率虽略有变化，但均处于同一显著水平，贮藏26个月后发芽率开始显著降低(表4-3-1)。但不同贮藏方式发芽指标出现显著下降的时期不同，常温和-50℃贮藏26个月的种子发芽率已开始显著降低，常温贮藏32个月的桔梗种子发芽率仅为20.6%，已基本失去种用价值;而干燥器贮藏、超干贮藏和4℃贮藏32个月的桔梗种子发芽率仍较高，分别为87.2%、86.4%和88.6%，其发芽势、发芽指数均高于对照，种子发霉率低于对照，种子综合性能明显优于对照;3种贮藏方式均可显著延缓桔梗种子劣变速率，有效保持种子活力，是桔梗种子贮藏的理想方式。

随着贮藏时间的延长，不同贮藏方式对桔梗种子发芽指标的影响不同。在贮藏前期的同一贮藏期内，桔梗种子同一发芽指标值在不同贮藏方式间无显著差异，贮藏后期不同贮藏方式间逐渐出现显著差异，但不同指标显著差异出现的时期不同;不同方式贮藏6～20个月的桔梗种子发芽率恢复到贮藏前的活力水平，发芽势和发芽指数比贮藏前还略有升高。

2.2　贮藏方式对桔梗种子浸出液电导率的影响

电导率是衡量种子细胞膜结构完整性的重要指标，电导率低表明种子膜结构完整性保存较好，细胞膜具有良好的选择透性，浸种时细胞内容物不易外渗，种子活力也较高。随着贮藏时间的延长，不同处理桔梗种子浸出液电导率均呈上升趋势，但不同贮藏时期上升幅度明显不同。0～6个月贮藏期间桔梗种子浸出液电导率上升幅度较小，月平均升高幅度仅为5.1μs·cm-1·g-1;贮藏6～10个月期间，浸出液电导率上升明显加快，月平均升高达89.5μs·cm-1·g-1，是前6个月的17.5倍;之后电导率升高幅度有所减缓，月平均增加14.9μs·cm-1·g-1。贮藏过程中桔梗种子浸出液电导率迅速增加期出现较早(在贮藏6～10个月)，表明在贮藏过程中桔梗种子出现发芽劣变前生理劣变已经发生，种子生理劣变是发芽劣变产生的重要诱因之一。

在同一贮藏期内，不同方式贮藏的桔梗种子电导率明显不同。在整个贮藏期4℃、干燥器贮藏和超干贮藏的种子浸出液电导率均低于-20℃、-50℃和常温处理(图4-3-1)。

图4-3-1　贮藏对桔梗种子电导率的影响

2.3　贮藏方式对桔梗种子POD活性的影响

POD作为植物体内抗氧化酶系重要成员参与清除种子过氧化作用产生的氧自由基等，避免活性氧等自由基积累，防止了其对膜脂等的攻击伤害，维持胞内生理环境的稳定而增加了种子保持其活力的能力，POD活性是衡量种子活力高低的重要生理指标之一。贮藏2个月时，除常温贮藏种子POD活性降低外，其他5种贮藏方式下种子POD活性均比原始活性有明显增加;之后随着贮藏时间的延长，不同方式贮藏的桔梗种子POD活性总体呈不断下降趋势(见图4-3-2)。在贮藏的后期(贮藏20～32个月)，4℃贮藏、干燥器贮藏和超干贮藏的种子POD活性均明显高于对照。

图4-3-2　贮藏对桔梗种子POD活性的影响

2.4　贮藏方式对桔梗种子MDA含量的影响

随着贮藏时间的增加，不同条件下贮藏的桔梗种子MDA含量总体上均呈上升趋势。常温下桔梗种子贮藏32个月其MDA含量上升了421.0%，平均每月上升13.2%。在贮藏的各时期，4℃下贮藏的种子MDA含量均低于对照常温贮藏(图4-3-3)。

图4-3-3　贮藏对桔梗种子POD活性的影响

3　讨论

桔梗以生长2～3年的根部入药，种子是药材生产的副产品，产量较低、贮藏寿命较短，种子收获后到翌年3月播种可获得较高的田间出苗率，一般认为贮藏到第二年的桔梗种子已基本失去种用价值;由于中药材市场的供需关系特殊性，桔梗种子供应很难满足市场需求变化，常常出现较大的供应过剩或缺口，研究桔梗种子贮藏特性对保持种子活力、延长其贮藏寿命，进而稳定市场供应具有一定价值。本研究结果表明:成熟好、净度高的桔梗种子常温贮藏20个月后其发芽率、发芽势分别为94.7%、84.0%，仍保持较高的活力和性能，桔梗种子贮藏到第二年仍有较高的种用价值，生产上桔梗种子不能隔年使用主要是由于种子生产和贮藏措施不当造成的。

贮藏温度是种子保持活力的关键因素之一，一般认为在一定范围内降低贮藏温度有利于种子保持其活力，延长贮藏寿命，但过低的贮藏温度可能引起种子质膜选择透性和细胞其他理化性质的改变，对种子贮藏性能产生不利影响。常温贮藏20个月后桔梗种子劣变加速，而低温贮藏可显著延缓种子衰老，4℃贮藏26个月时其发芽率、发芽势分别为92.7%、78.7%，分别是常温贮藏的1.6倍和13.1倍;而温度进一步降低，种子耐藏性能有所下降。

种子贮藏在开放的环境中，外界环境湿度的变化常引起种子含水量的起伏，干燥而恒定的外界湿度有利于种子耐藏性的保持。桔梗种子在干燥器和超干贮藏均可有效延缓种子衰老，两种方式贮藏32个月后种子发芽率分别为87.2%、86.4%，分别是对照(常温贮藏)的4.23和4.19倍，发芽势分别是对照的17.6和16.1倍。

在种子老化劣变机理中，自由基学说已受到人们的广泛关注，认为生物细胞乃至整个生命的衰老是与自由基代谢失调相关联的。植物细胞能通过多种途径，如分子氧单电子还原过程、某些酶催化过程和某些低分子化合物的自动氧化，不断地产生O2-、H2 O2、羟自由基和单线态氧等自由基。在正常生理状态下，自由基的产生与清除处于平衡状态，不会使植物细胞受到伤害;但在衰老或逆境胁迫下，这种平衡就会遭到破坏，使内源性自由基的产生和消除失去平衡，所积累的自由基若得不到及时消除，会引发或加剧细胞膜脂过氧化，造成膜系统的损伤，严重时导致细胞死亡。本研究中随贮藏时间的增加，桔梗种子POD活性逐渐降低，清除自由基能力减弱，MDA含量增加，对质膜的攻击破坏作用增加，质膜完整性下降，细胞内容物易于外渗，种子带菌率增加，活力降低。

4　结论

以原始活力相同的桔梗种子为材料，研究不同贮藏方式(干燥器贮藏、干燥剂包埋贮藏)和不同温度(常温、4℃、-20℃、-50℃)下桔梗种子在贮藏过程中其活力的动态变化规律，探讨桔梗种子贮藏的适宜方式。结果表明:随着贮藏时间的增加，不同方式贮藏的桔梗种子发芽率、发芽势、活力指数、POD活性基本呈下降趋势;而发霉率、电导率、MDA含量呈上升趋势;在贮藏过程中种子活力不断下降，但4℃、干燥器贮藏、干燥剂包埋贮藏均可有效延缓种子劣变，3种方式贮藏32个月的桔梗种子发芽率均在86.4%以上，发芽势在51.4%以上，仍保持较高的活力，是桔梗种子贮藏的有效方式。

综上所述，4℃、干燥器和超干贮藏均可有效延缓桔梗种子的衰老，增加种子寿命;依据简便原则综合考虑贮藏成本，本研究认为4℃和干燥器是贮藏桔梗种质资源和育种小材料的有效方法;对大批量桔梗种子的贮藏可采用密闭和放置干燥剂的方法降低和稳定仓库内湿度，以达到延缓种子劣变的效果。