干旱胁迫对桔梗光合特性和叶绿体超微结构的影响

土壤有效水分的匮乏会对植物生长状况、形态结构与生理生态过程产生显著影响，因此土壤水分状况与植物间的关系一直是植物生理生态学研究领域的热点问题之一。大多数植物在干旱胁迫下气孔关闭，叶片水势下降，形态特征及生物量分配格局也发生变化，使植物机体受到胁迫伤害甚至死亡，植物也在长期演化过程中进化出了通过调节体内一系列生理生化过程以适应干旱胁迫生境的防御机制。

桔梗种子萌发阶段很容易遭受干旱胁迫干扰，叶绿体是植物进行光合作用的重要细胞器，也是对干旱等逆境胁迫最为敏感的靶点部位之一，干旱下叶绿体结构完整性是影响其光合功能的决定因素;叶片气孔是植物有机体与外界环境进行物质交换的重要通道，气孔可改变自身状态敏感地响应干旱等逆境，通过控制气体交换和水分蒸腾影响光合等生理过程。低温条件下桔梗叶片光合特征及有机物积累与分配，作物通过光合作用形成有机物质，光合作用也是植物受干旱影响最明显的生理过程之一。目前对干旱下桔梗光合机构和光合特性变化、光合产物分配和积累特征等了解甚少。探讨干旱下桔梗叶片光合色素含量、气孔形态特征、叶绿体超微结构、光合特性及有机物分配和积累规律，阐明桔梗干旱光合机理，为桔梗干旱光合效率改良和抗旱选育提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料及处理

以商州桔梗(栽培种)种子为供试材料，2014年3月穴盘播种后移入日光温室内进行苗期培养，日光培养箱温度设置昼(25±1)℃12 h/夜(18±1)℃12 h，子叶叶完全展开后，选择生长发育健壮长势一致的幼苗移栽至直径15cm的盆钵中，每盆3株;3片真叶时进行PEG-600模拟干旱胁迫处理，依据前期试验结果设置处理浓度，处理前7d停止浇水，使土壤水分下降到40%WHC左右，此时盆土实际质量含水量为16%左右;分别添加体积分数为5%、10%、20%的PEG-6000溶液，添加后将盆钵处于28℃让土壤水分不断蒸发，每天用称重法补充PEG-6000溶液至原重，2d后水分蒸发量达到盆土质量的16%左右，此时作为干旱处理的起始时间，干旱处理7d后于上午10:30测定光合气体交换参数和叶绿素含量;测定后撕取叶片表皮，徒手切片观察气孔形态;叶脉间取2～4mm小块，2.5%戊二醛固定供超薄切片观察叶绿体结构。

1.2　测定指标与方法

1.2.1　形态观察

处理后观察记载叶片状态、叶色等变化。

1.2.2　叶片气孔形态观察

低温处理后取新展开叶片为材料，采用水封片法观察叶片表皮及气孔形态。用镊子轻轻撕下叶片表皮，置于加1～2滴I2-KI染液的载玻片上，使表皮展开，盖上盖玻片，显微观察并照相。气孔开张度即为开张气孔的最宽直径，气孔开张比是开张的气孔数与总气孔数之比。

1.2.3　叶绿体超微结构观察

低温处理后选新展开叶片叶脉间取2～4mm小块，2.5%戊二醛固定，0.1mol·L-1 PBS缓冲液中冲洗，再经1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，Epon 812树脂浸透、包埋、聚合。超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，JEM-1200EX透射电镜观察、测量和拍照。

1.2.4　 RuBPCase活性测定

参照龚富生的方法测定RuBPCase活性。称取桔梗完全展开的新叶0.5g，用预冷的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，冰浴研磨后转移至离心管，4℃下14 000 r/min离心15min，取上清液为酶液。根据NADPH的氧化或NADP+的还原，于340 nm测定光吸收值的变化，计算酶活力。

1.2.5　光合参数测定

低温处理后选新展开叶片，采用LI-6400便携式光合仪测定叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)等，叶室(2cm×3cm)内设定温度20℃，光强为600μmol·m-2·s-1;同时采用叶绿素仪测定叶片叶绿素含量、氮素含量、水分含量。每个处理选3株，每株读数3次。

1.2.6　光合产物的积累及分配特征测定

低温处理后将植株从盆钵中整株取出，带回实验室冲洗干净，用吸水纸吸干，室温晾10min后测定根长、根粗、侧根数、叶片长度、宽度、叶数;并称量地上部鲜重、地下部鲜重;之后将叶片及根部切成片状，置于铝盒中90℃过夜，次日称取地上部干重、地下部干重;植株含水量%=(鲜重-干重)/鲜重×100%;根冠比=地下部干重/地上部干重。

1.3　数据分析处理

利用SPSS软件对实验数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　干旱胁迫对桔梗幼苗形态特征的影响

水分亏缺常常引起植物形态特征的相应改变，特别是植物叶片特征的改变更为明显。对照幼苗叶色亮绿、叶片平展、生长势强;10%PEG处理的幼苗叶片颜色加深、色泽也逐渐由亮变暗，叶面变小，叶片边缘卷曲变黄;20%PEG叶片卷曲程度逐渐加重，叶色变为暗绿色(表5-2-1)。

表5-2-1　干旱胁迫对桔梗幼苗形态特征的影响

2.2　干旱胁迫对桔梗叶片气孔形态的影响

叶片气孔是植物体与外界环境进行气体等物质交换的重要通道，气孔通过改变自身开闭状态控制CO2、O2等的进出，对光合效率产生重要影响。随着干旱程度加重，气孔开度也逐渐变小，直至完全关闭。对照叶片气孔完全开放，保卫细胞叶绿体可观察到有较多淀粉粒;10%PEG-6000处理9d后多数气孔已变为半开状态，有部分气孔完全关闭，淀粉颗粒变小、数量减少;PEG-6000浓度升高到20%时，基本所有气孔处于完全关闭状态，叶绿体中已基本无淀粉粒形成(图5-2-1)。

图5-2-1　干旱胁迫处理后桔梗幼苗叶片气孔形态变化

1.对照，×200;2.10%PEG处理，×200;3.20%PEG处理，×200

2.3　干旱胁迫对桔梗叶片光合色素含量的影响

叶绿素在光合作用的光反应阶段具有捕获光子、转化光能和电子传递等重要作用，叶绿素含量高低影响着光反应效率。随着干旱胁迫程度的增加，桔梗叶片叶绿素含量呈下降趋势。10%PEG处理的桔梗幼苗叶片叶绿素含量比对照下降31.9%;20%PEG的处理后叶片叶绿素含量比对照下降62.4%，此时桔梗幼苗下部叶片已出现明显黄化，叶片叶绿素受干旱胁迫后降解严重(图5-2-2)。

图5-2-2　PGE处理对桔梗幼苗叶片叶绿素含量的影响

2.4　干旱胁迫对桔梗叶片叶绿体超微结构的影响

为进行干旱胁迫处理的桔梗幼苗叶片叶绿体呈单面凸透镜形或梭形，外膜清晰，紧贴细胞内膜规则连续排列，在两细胞紧密接触处无叶绿体分布出现形成间断(图5-2-3，4);叶绿体片层结构规则有序，基粒片层沿叶绿体纵轴垛叠整齐紧密，基质片层清晰有序;叶绿体内含有淀粉粒，其数量平均为3.2粒(图5-2-3，1)。10%PEG处理7d后，桔梗幼苗叶片叶绿体由透镜状变为扁平状，相邻叶绿体外膜边界变模糊，部分叶绿体被膜溶解(图5-2-3，5);基粒数量减少，基粒片膜结构模糊(图3-2)。20%PEG处理后，桔梗叶片叶绿体结构已完全破坏，大部分叶绿体外膜溶解，叶绿体内容物渗出(图5-2-3，3);基粒片层垛叠结构消失，仅留断裂的基质片层残迹(图5-2-3，6)。

图5-2-3　夜间低温对桔梗叶片叶绿体超微结构的影响

1～3示叶绿体、基粒、基粒片层、基质片层、叶绿体内淀粉粒，其中“1”为正常水分下叶绿体结构，“2”为10%PEG处理的叶绿体结构，“3”为20%PEG处理的叶绿体结构;
4～6示叶绿体在叶肉细胞内的排列和形态，其中“4”为正常水分的叶肉细胞和叶绿体，“5”为10%PEG处理的叶肉细胞和叶绿体，“6”为20%PEG处理的叶肉细胞和叶绿体。

2.5　干旱胁迫对桔梗幼苗叶片光合气体交换参数的影响

随着干旱胁迫程度的增加，桔梗幼苗叶片Gs、Tr、Pn均显著降低，而Ci先降低后略升高。未干旱胁迫的桔梗幼苗叶片气孔导度高，蒸腾速率强，光合速率最大为0.823μmol CO2·m-2·s-1，光合固氮能力最强。10%PEG处理后，桔梗叶片Gs、Pn降低，CO2通过气孔向叶片胞间输入量和光合固定输出量均减少量，但CO2胞间输入量低于光合固定量，导致Ci降低，此时Pn下降主要由气孔限制引起。而20%PEG处理后，桔梗叶片Gs、Pn降低，而Ci略有升高，表明CO2胞间输入量高于光合固定量，Pn下降的主要原因是非气孔限制，即光合系统效率降低所致(表5-2-2)。

表5-2-2　干旱胁迫对桔梗叶片光合气体交换参数的影响

2.6　干旱胁迫下桔梗幼苗酶活性及表达分析

干旱对桔梗叶片光合固碳过程产生显著影响，随着干旱胁迫程度增加，桔梗叶片RuBPCase活性显著逐渐降低，但处理间降低幅度不同。与未胁迫处理相比，10%PEG处理的桔梗叶片RuBPCase活性下降了26.4%;而20%PEG处理的桔梗叶片RuBPCase活性下降了73.2%，处理间差异均达极显著水平。

图5-2-4　干旱胁迫下桔梗幼苗叶片RuBPCase活性

2.7　干旱胁迫对桔梗光合产物分配的影响

随着干旱胁迫程度的增加，桔梗幼苗地上部、总质量逐渐下降;但地下部质量、根冠比呈先上升后下降的趋势，表明遇到干旱胁迫后桔梗幼苗总的有机物积累量和存留部茎叶中的有机物均减少;而中度干旱胁迫有利于光合产物向根部的运输，促进根部生长。

表5-2-3　干旱胁迫下桔梗物质分配及积累特征

3　讨论

气孔是植物与环境进行气体交换和水分蒸腾的主要通道，气孔密度、开张度、开张比及气孔导度影响光合作用的进行。10%PEG模拟干旱胁迫下，桔梗幼苗叶片多数气孔已处于关闭或半关闭状态，桔梗叶片气孔Gs降低，使CO2向胞间的输入量减少，引起Pn降低，表明此时光合速率的降低主要由气孔限制引起;当20%PEG模拟干旱胁迫下，桔梗叶片多数气孔完全关闭，其Ci升高，而Gs、Pn降低，表明此时光合速率的降低主要由非气孔限制引起。

叶绿素是植物重要的光合色素，在光子捕获、光能转换和电子传递等过程中起重要作用，叶绿素含量和性能对叶片光合作用具有重要影响。植物叶绿素的合成和降解受到光照、水分、温度等环境因子的影响，干旱胁迫下叶绿素合成受阻，降解加速;但水分缺乏引起叶绿素合成抑制，随植物抗旱性不同存在明显差异，一般而言，引起水分变化敏感植物叶绿素合成受阻的胁迫程度低于抗旱植物，强抗旱类型叶绿素合成可仍受更严重的干旱。本研究结果显示10%PEG模拟的干旱，就可引起桔梗叶片叶绿素含量显著降低，表明桔梗苗期叶片叶绿素合成与降解对水分变化非常敏感;此时叶片叶色外观变为暗绿，叶片Pn明显降低;叶绿素在干旱下合成受阻、降解加速，叶片Pn明显降低;同时显微观察也发现叶绿体结构发生改变，基粒溶解、基质片层断裂，其膜有序结构被严重破坏;光合膜结构稳定性对光合机构发挥职能具有重要作用，膜及结合分子的有序性、膜囊内外电荷规则分布和膜电势形成，影响光能捕获和转换、电子传递和光合磷酸化等，进而影响光合作用的高效进行;基粒垛叠结构和基质片层损失导致膜结合分子排列有序性的丧失和跨膜电势建立困难，最终导致叶片Pn的降低。

4　结论

采用PEG模拟法，探讨干旱胁迫对桔梗幼苗叶片气孔形态、叶绿体超微结构、光合特性及产物分配与积累规律，为桔梗苗期抗旱种质创制及品种选育提供依据。结果表明，随干旱胁迫程度增加，桔梗叶片叶绿素含量逐渐下降，叶色变浅失绿，气孔逐渐关闭，RuBPCase活性、Pn、总物质积累量降低;地下部物质量、根冠比呈先升后降的趋势。正常水分下桔梗叶片叶绿体呈单面凸透镜形或梭形，外膜清晰，基粒片层沿叶绿体纵轴垛叠整齐紧密，基质片层清晰有序，叶绿体内平均含3.2粒淀粉;10%PEG处理7d后，桔梗幼苗叶片叶绿体外膜边界变模糊，基粒数量减少;20%PEG处理后，大部分叶绿体外膜溶解，基粒片层垛叠结构消失，仅留断裂的基质片层残迹。