桔梗种子萌发及幼苗生长对干旱胁迫的形态与生理响应

桔梗种子较为细小，千粒重平均约为1.0g，桔梗土壤种子库通常分布在2cm左右的土壤表层，由于春季多风、温度回升快、降雨也逐渐增多，很容易导致表层土壤种子处于干湿交替的环境之中，使种子萌发阶段遭受干旱胁迫干扰，影响其种群更新过程和群体规模维系;人工栽培中水分限制也是产量形成的主要限制因素之一。但目前就桔梗种子萌发和幼苗生长对干旱环境的适应能力及适应机制的研究尚未见报道，本试验采用聚乙二醇(PEG-6000)作为水分胁迫剂模拟不同程度的干旱胁迫，探讨桔梗种子萌发和幼苗生长对干旱胁迫的适应与响应，主要目的在于:①阐明干旱胁迫下桔梗种子萌发特性、幼苗生长、形态特征、生物量分配、体内深透调节能力、抗氧化能力、伤害程度等的变化特征;②探讨桔梗幼苗对干旱生境的适应能力和适应对策。

1　材料与方法

1.1　材料

供试桔梗种子为2008年10月采自陕西香菊制药有限公司商洛植物药园二年生栽培群体，选取深黑色大小基本一致的饱满种子为实验材料;供实验用的桔梗幼苗，由种子萌发培养得到。

1.2　方法

1.2.1　种子萌发试验

选取桔梗优质种子用0.4%的KMnO4溶液表面消毒，蒸馏水冲干净，培养皿垫双层滤纸作为发芽床，将供试种子分别放入加有等量体积浓度为5%、10%、15%、20%、25%的聚乙二醇溶液(PEG-6000)和蒸馏水(对照)的发芽床中，每皿100粒，准确称重后，放入培养箱25℃光培养，以后每日观察统计种子萌发情况，并根据实际情况添加蒸馏水至原始重量，每处理重复5次。胚根与种子等长为种子发芽标准，8d计发芽势，11d计发芽率，发芽结束后计算发芽指数和活力指数，测定胚根和胚芽长度，并称其鲜重。相关指标计算公式如下:

(1)种子活力指标:种子发芽率(%)=n/N×100%;种子相对发芽率(%)=(PEG处理组发芽数/对照组发芽数)×100%;发芽指数(GJ)=∑Gt/Dt;活力指数(VI)=发芽指数(GJ)×S。式中，n为发芽终期全部正常发芽的种子数，N为供试种子总数;Gt为t日发芽数，Dt为相应的天数。S为平均胚根鲜重。

(2)胚根和胚芽平均长度:在种子萌发实验进行12d后，每一重复各取10株测定其胚根和胚芽长度，并计算平均值。同时，称取幼苗鲜重。

(3)抗旱极限浓度(%):以发芽率达对照发芽率10%以下的相对应PEG浓度为种子抗旱极限浓度。

(4)抗旱半致死浓度(%):发芽率达对照发芽率50%时相对应的PEG浓度为种子抗旱半致死浓度。

1.2.2　幼苗干旱处理

石英砂、蛭石和有机肥按一定比例混合均匀配成基质，称取等量基质分装于盆钵组成培养床，选取发育良好的桔梗种子播种于基质中，每杯播种20粒种子后，添加适量的蒸馏水并称重，以后每天根据蒸发量添加蒸馏水。将播种的盆钵放入人工气候箱中进行培养(温度28℃，光照时间24 h)，子叶离开土面1cm后，在28℃(昼)/18℃(夜)下进行变温培养，光强500μmol·m-2·s-1，每日光照12 h。第一对真叶展开后定苗，每杯选取发育良好的大小一致的幼苗10株继续培养。

三对真叶展开后进行模拟干旱处理，处理前7d停止浇水，使土壤水分下降到40%WHC左右，此时盆土实际质量含水量为16%左右。分别添加体积分数为5%、10%、15%、20%、25%的PEG-6000溶液，添加后将盆钵处于在28℃环境让土壤水分不断蒸发，每天用称重法补充PEG-6000溶液至原重，2d后水分蒸发量达到盆土质量的16%左右，此时作为干旱处理的起始时间，干旱处理7d后观察幼苗形态反应和干旱表现，以蒸馏水处理为对照，并测定叶片各项生理指标。

1.2.3　测定指标及方法

可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法，游离脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法［14］，超氧化物歧化酶(Superoxide dismultase，SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法，过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性采用紫外吸收法，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法［15］。实验设置3次重复。气孔观察采用指甲油印膜法［16］，将功能叶片下表皮取下制成临时切片，光学显微镜观察气孔特征。

干旱处理期间观察叶片形态、气孔状态等变化情况，根据幼苗形态特征按4级标准记载和评级，级数越小，受干旱胁迫危害越轻。1级，无受害症状，气孔开放;2级，小部分叶片萎缩，并失去应有光泽，有较少的叶片卷曲，气孔半开放，有少部分气孔关闭;3级，大部分叶片萎缩卷曲，多数气孔关闭;4级，叶片卷缩严重，颜色显著深于该品种正常颜色，下部叶片开始变黄，气孔全部关闭。

1.2.4　数据处理

利用SPSS软件对实验数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　干旱胁迫对桔梗种子发芽起始时间的影响

根据观察记录，对照种子在萌发培养的6d时5个重复均开始大量萌发，培养皿中加5%PEG-6000溶液的处理也开始萌发，但萌发种子数明显少于对照(培养6d时对照萌发种子数平均为21.6，而5%PEG-6000实验组发芽种子数为15.0);10%PEG-6000溶液的处理培养6d时有2个重复有种子萌发;15%PEG-6000溶液的处理培养8d仅1个重复萌发;20%PEG-6000溶液的处理仅1个重复培养11d有种子萌发;25%PEG-6000溶液的处理未见有种子萌发。

2.2　干旱胁迫对桔梗种子萌发的影响

发芽率反映了种子在适宜条件下的萌发能力，活力指数是种子活力水平的综合体现。不同浓度PEG-6000对桔梗种子萌发的影响见表5-1-1，从表中可以看出，随着PEG处理浓度的增加(即干旱胁迫程度的加深)，桔梗种子发芽率、相对发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均呈下降趋势，当PEG浓度增加到20%时，发芽势和活力指数分别由对照的26.8%和3.04下降为0，当PEG浓度升高为25%时，其他各发芽指标也均下降为0，表明20%PEG-6000已完全抑制了桔梗种子的萌发。

从表5-1-1中还可以看出，各种浓度的PEG-6000实验组种子各萌发指标均低于对照，但不同浓度的PEG-6000对桔梗种子萌发的影响效应不同，低浓度PEG-6000(≤5%)实验组种子发芽势比对照显著降低，而其他各萌发指标比对照略有降低，但均未达到显著差异水平;高浓度PEG-6000实验组各萌发指标均显著低于对照。10%PEG-6000和15%PEG-6000实验组种子发芽率分别为对照发芽率的56.5%和14.1%，表明桔梗种子抗旱半致死PEG-6000浓度和抗旱极限PEG-6000浓度分别在10%和15%以上。

表5-1-1　干旱胁迫对桔梗种子萌发的影响

注:不同小写字母表示胁迫浓度间在0.05水平差异显著，下同。
Note:Different normal letters show significant difference among PEG concentrations at P＜0.05，the same as below.

2.3　干旱胁迫对桔梗胚根和胚芽生长的影响

干旱胁迫对桔梗幼苗生长的影响情况见表5-1-2。从表中可以看出，实验组幼苗鲜重、胚芽长、胚根长和胚根/胚芽均比对照明显降低，但不同浓度PEG-6000对桔梗幼苗生长指标的影响效果不同，低浓度PEG-6000(≤5%)处理的幼苗其胚芽长、胚根/胚芽和苗鲜重3个指标比对照略有降低，但差异不显著，而此时胚根长度已显著变短，表明轻度干旱胁迫即可显著抑制桔梗幼苗胚根的生长，幼苗胚根/胚芽的下降主要由胚根长度降低引起的。

表5-1-2　干旱胁迫对桔梗幼苗生长的影响

随着PEG-6000处理浓度的增加，各幼苗生长指标均呈下降趋势;胚芽长、胚根长和胚根/胚芽3个指标在不同浓度PEG-6000处理间均存在显著差异，而PEG-6000处理浓度的增加对幼苗鲜重没有显著影响。

2.4　干旱胁迫对桔梗幼苗形态特征的影响

水分亏缺常常引起植物形态特征的相应改变，特别是植物叶片特征的改变更为明显。干旱胁迫对桔梗幼苗形态特征的影响见表5-1-3，与对照相比，低浓度PEG-6000(5%)处理的桔梗幼苗叶色亮绿、气孔开放正常，无明显受害症状，但随着处理浓度的增加，叶片颜色逐渐加深、色泽也逐渐由亮变暗，叶面逐渐变小、卷曲程度逐渐加重，气孔开度也逐渐变小，直至完全关闭。10%PEG-6000处理9d后多数气孔已变为半开状态;PEG-6000浓度为15%时，已有部分气孔完全关闭;PEG-6000浓度升高到20%时，基本所有气孔处于完全关闭状态，以减少植物体内水分的散失。

表5-1-3　干旱胁迫对桔梗幼苗形态特征的影响

2.5　干旱胁迫对桔梗幼苗渗透调节物质含量的影响

游离脯氨酸和可溶性糖在植物体内具有广泛的生理作用，也是两种重要的渗透调节物质，参与调节细胞水势变化。表5-1-4显示了桔梗幼苗游离脯氨酸和可溶性糖含量随干旱胁迫程度增加的变化情况，随着PEG-6000处理浓度的增加，游离脯氨酸和可溶性糖含量均呈“单峰”曲线变化趋势，即低浓度范围随PEG-6000浓度的增加其含量逐渐升高，当PEG-6000浓度为10%和15%时游离脯氨酸和可溶性糖含量分别达到最大值，为3.97μg·ml-1和296.5μg·ml-1，之后随处理浓度继续增加其含量开始下降。与对照相比，10%PEG-6000处理的幼苗脯氨酸含量略高于对照，5%处理其含量略低于对照，但差异均不显著，高浓度PEG-6000(≥15%)处理游离脯氨酸含量均显著低于对照。低浓度PEG-6000(≤5%)处理桔梗幼苗可溶性糖含量略低于对照，而用浓度高于10%PEG-6000处理后其含量显著高于对照。

表5-1-4　干旱胁迫对桔梗幼苗渗透调节物含量的影响

2.6　干旱胁迫对桔梗幼苗抗氧化酶系统的影响

3种抗氧化酶SOD、POD和CAT活性及脂质过氧化终产物MDA含量变化情况见表5-1-5。

表5-1-5　干旱胁迫对桔梗幼苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

从表中可以看出:①与对照相比，不同浓度PEG-6000处理后桔梗幼苗叶片SOD活性均显著升高，而POD活性均显著下降，低浓度PEG-6000(5%)处理后叶片CAT活性比对照略有升高，但差异不显著，较高浓度PEG-6000(≥10%)处理后叶片CAT活性比对照显著降低;PEG-6000处理后的幼苗叶片MDA含量均显著高于对照。②随着PEG-6000处理浓度的增加，CAT活性基本表现体积分数依赖趋势，即随干旱胁迫程度的增加，CAT活性呈明显下降趋势;SOD活性、POD活性及MDA含量变化趋势基本相同，均呈“单峰”曲线变化，即随PEG-6000处理浓度的增加，这3个指标先呈上升趋势，达到最大值后又开始下降。

3　讨论

伴随植物呼吸作用的进行，其体内不断产生对植物细胞有危害作用的活性氧等自由基，在正常情况下，植物体内活性氧等自由基的产生和清除处于动态平衡状态，但在生境胁迫、代谢紊乱、衰老劣变等特殊情况下，常常诱导体内活性氧等自由基的增加，导致机体受到各种伤害。植物体内负责清除氧自由基的酶系主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等。干旱胁迫是植物生长的逆境之一，植物在干旱胁迫条件下，活性氧等自由基的增加引起膜脂过氧化，并可导致细胞膜结构及其生理完整性的破坏，抗氧化酶系可有效清除活性氧自由基，缓解干旱胁迫对植物造成的伤害。抗氧化酶系活力的变化是影响植物体内自由基生成与清除平衡的重要因素，植物对干旱胁迫抗性的形成是几种抗氧化酶协同作用的综合结果。干旱胁迫下五爪金龙、飞机草、枣树幼苗SOD上升，CAT下降;空心莲子草POD活性在轻、中度干旱胁迫时上升，重度胁迫时下降。桔梗幼苗SOD活性变化与上述研究结果基本相同，即在干旱胁迫下桔梗幼苗SOD活性显著上升，而POD活性显著下降，CAT活性在轻度胁迫时上升，中度、重度胁迫时下降，这与前人结果略有不同，其原因可能是不同植物幼苗对干旱胁迫应答的生理特征和机制有所不同造成的。一般认为丙二醛在植物体内积累是活性氧毒害的表现，它的含量是判断膜脂过氧化程度的一个重要指标，许多研究表明干旱胁迫下植物体内会积累MDA，桔梗幼苗受到干旱胁迫后体内同样也会积累MDA，表明在干旱胁迫下桔梗幼苗总体朝生理劣变方向发展。

游离脯氨酸和可溶性糖在植物体内具有广泛的生理作用，不仅可为植物的生命活动提供能量和为其他物质的合成提供中间产物，同时还是细胞重要的渗透调节物质，其含量的高低通过影响细胞水势而控制植物水分的进出。焦树英等、付秋实等人认为干旱胁迫下狼尾草、辣椒细胞内游离脯氨酸含量明显升高，以增加抗旱性能。本研究结果显示，桔梗幼苗在轻度、中度干旱胁迫下游离脯氨酸含量变化不明显，在重度胁迫下游离脯氨酸含量比对照显著降低，而可溶性糖含量显著升高，以相对提高幼苗对干旱胁迫的适应能力。

在人工栽培中，桔梗种子通常播种在2cm左右的土壤表层，由于春季多风、温度回升快、降雨也逐渐增多，很容易导致表层土壤种子处于干湿交替的环境之中，使种子萌发阶段遭受干旱胁迫干扰。轻度、中度干旱胁迫对一些植物种子胚根生长影响不明显，而桔梗种子遇到较低程度干旱胁迫时即表现为发芽率降低，胚根生长显著被抑制而伸长缓慢，幼根不能迅速深入深层土壤吸收水分，造成桔梗种子萌发及幼苗阶段对水分亏缺十分敏感，较低程度的干旱胁迫即可引起桔梗幼苗生长困难，为了弥补这种生存缺陷，桔梗种子采取了“避害”的生存策略。桔梗种子千粒重仅为1.0g左右，能供给萌发和胚芽、胚根伸长的种子贮藏物质十分有限，在正常水分条件下，桔梗种子萌发结束后其幼苗根茎比为5.72，这远高于其他许多植物。这表明当表层土壤较为湿润时，萌发后的桔梗种子能迅速调动其贮藏物质优先供给胚根生长，使胚根在较短的时间内迅速伸长并伸入深层土壤吸取土壤深层水分，从而降低桔梗种子萌发阶段遇到土壤表层干旱胁迫的风险。

4　结论

(1)在干旱胁迫下桔梗种子初始萌发时间延后，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚芽长、胚根长、根长/芽长和苗鲜重等指标均比对照明显降低，且随干旱胁迫程度的增加，上述各指标均呈显著下降趋势;干旱胁迫对桔梗幼苗胚根生长的抑制作用比对胚芽更为明显。

(2)10%PEG-6000处理的幼苗脯氨酸含量略高于对照，其余各处理游离脯氨酸含量均低于对照;低浓度PEG-6000(≤5%)处理桔梗幼苗可溶性糖含量略低于对照，而高于一定浓度PEG-6000(≥10%)处理后其含量显著高于对照。

(3)与对照相比，不同浓度PEG-6000处理后桔梗幼苗叶片SOD活性均显著升高，而POD活性均显著下降，低浓度PEG-6000(5%)处理后叶片CAT活性比对照略有升高，但差异不显著，较高浓度PEG-6000(≥10%)处理叶片CAT活性比对照显著降低;PEG-6000处理后的幼苗叶片MDA含量均显著高于对照。研究发现，干旱胁迫对桔梗种子萌发和幼苗生长具有明显的抑制作用，轻度干旱胁迫显著抑制桔梗胚根生长可能是造成桔梗种子田间出苗率低的主要原因之一。