桔梗花粉活力离体测定方法研究

花粉活力测定有很多种方法，主要有显微镜形态观察法、染色法、离体萌发法等，其中花粉离体萌发与花粉管生长测定结果较为稳定，更能反映花粉活力的实际状况。花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基基本成分是糖和硼，蔗糖浓度一般为10%～20%，硼酸为0.001%～0.005%，pH 5.5～6.5。不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓度不同，二核型花粉较易萌发，在一般基本培养基上培养即可，而三核型花粉较难萌发，要在基本培养基的基础上添加其他促进花粉萌发的元素，如Ca2+，Mg2+，K2+，PEG等成分。近年来，人们对药用植物花粉离体萌发和花粉管生长进行了较多研究，赵宏波等认为PEG对菊花、梅花花粉离体萌发生长具有显著促进作用;牛东玲等报道了肉苁蓉花粉离体萌发的适宜培养基，陈和明等研究了黄藤花粉离体萌发条件及低温贮藏对花粉活力的影响;刘自刚等研究了贮藏温度与桔梗花粉活力变化的关系。本节研究不同培养基种类、不同组分浓度以及培养条件对桔梗花粉离体萌发和花粉管生长的影响，以期筛选出桔梗花粉离体萌发的最适培养体系，为桔梗花粉活力测定提供一种快速高效方法。

1　材料与方法

1.1　材料

供试材料桔梗花粉为2008年7月中旬采自陕西商洛香菊制药公司药用植物园二年生桔梗群体。

1.2　方法

1.2.1　花粉采集

选取发育正常、无病虫为害的健壮植株，盛花期于上午7:00～8:00选取当日开放的花朵，后连同一段枝叶一起将花朵采下，迅速移入盛有清水的三角瓶中，带回实验室待花粉从花药中散出，将花粉收集起来备用。

1.2.2　培养基筛选

实验设置3种不同的培养基分别为:①BK+150g·L-1 PEG4000+100g·L-1蔗糖;②ME3+150g·L-1 PEG4000+100g·L-1蔗糖;③ME3+BK+150g·L-1 PEG4000+100g·L-1蔗糖。其中ME3组成成分为(单位:mg·L-1):MgSO4·7H2 O 370，KNO3 950，KH2 PO4 85，CaCl·2H2 O 880，NH4 NO3 412.5，KCl 175，H3 BO3 50，Na2 EDTA 7.45，FeSO4·7H2 O 0.025，KI 0.83，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，VB1 1.0，VB6 1.0;BK成分(单位:mg·L-1):H3 BO3 100，Ca(NO3)2·4H2 O 300，MgSO4·7H2O 200，KNO3 100。

1.2.3　 PEG浓度试验

把新鲜花粉均匀散布在蒸馏水和增加了100g·L-1、150g·L-1、200g·L-1、250g·L-1 PEG4000的ME3+BK培养基中，盖上盖玻片于光照培养箱中培养。

1.2.4　蔗糖浓度试验

在ME3+BK+150g·L-1 PEG4000的培养基中分别增加50g·L-1、100g·L-1、150g·L-1、200g·L-1的蔗糖，比较不同浓度的蔗糖对花粉萌发和花粉管生长的影响。

1.2.5　培养温度和培养时间试验

在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃5种不同温度条件下，用ME3+BK 150g·L-1 PEG6000+100g·L-1蔗糖作为花粉萌发培养基，分别培养15min、30min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、7.5 h后观察花粉萌发和花粉管生长情况，筛选最适培养温度和培养时间。

1.2.6　 pH梯度试验

在pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的ME3+BK+150g·L-1 PEG6000+100g·L-1蔗糖培养基上培养桔梗新鲜花粉，检测培养基不同pH对桔梗花粉萌发和花粉管生长的影响。

1.2.7　花粉萌发方法

将花粉培养液滴入凹形载玻片凹槽中，当天采集的桔梗花粉混合均匀后，用毛笔蘸取适量匀撒在培养基上，置于底部垫有双层滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入恒温培养箱内30℃培养，1.5 h后进行花粉萌发率统计和花粉长度测量。

1.2.8　花粉管生长情况

以pH5.8的ME3+BK+150g·L-1 PEG 4000+100g·L-1蔗糖为培养基，于培养后5min、10min、15min、30min、45min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、9 h定时观测花粉管生长情况。

1.2　.9花粉萌发和花粉管长度检测

以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率;同时用显微测微尺测量花粉管长度(μm)，每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值。

2　结果与分析

2.1　培养基对桔梗花粉萌发生长的影响

培养基种类对植物花粉离体萌发有较大影响，不同植物花粉萌发的适宜培养基不同。由表2-6-1可以看出桔梗花粉在设计的3种培养基溶液中均可萌发，但花粉萌发率和花粉管生长速度存在显著差异，其中在ME3+BK+150g·L-1 PEG+100g·L-1蔗糖培养基上桔梗花粉能够较好萌发，其萌发率可达到96.0%，花粉管也能得到较好生长。

表2-6-1　培养基对桔梗花粉萌发率的影响

2.2　不同浓度PEG对花粉萌发生长的影响

PEG4000是一种高分子量化合物，主要起到渗透调节作用。从表2-6-2中可以看出，ME3+BK+100g·L-1蔗糖培养基中加入不同浓度的PEG4000，可明显提高桔梗花粉萌发率，其中添加150g·L-1 PEG4000效果最为显著，花粉萌发率达到96.0%;低浓度PEG(100g·L-1～200g·L-1)促进花粉管生长，且随浓度增加，促进作用逐渐减弱，高浓度PEG(≥250g·L-1)抑制花粉管生长。在显微观察时还发现，在添加了PEG的培养基中，桔梗花粉管生长较直，而未加PEG的培养基花粉管生长弯曲，常交织在一起，不便观察测量。

表2-6-2　不同浓度PEG4000对花粉萌发生长的影响

2.3　不同浓度蔗糖互作对花粉萌发生长的影响

蔗糖是一种渗透调节物质，同时也是花粉管生长的能源物质。由表2-6-3可见，ME3+BK+150g/L PEG培养基中不同浓度蔗糖对桔梗花粉萌发率和花粉管生长影响不同，低浓度蔗糖(≤100g·L-1)对花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，而高浓度的蔗糖(≥150g·L-1)可明显抑制花粉萌发和花粉管生长，且随着蔗糖浓度的增加，受到抑制程度更明显。在含有100g·L-1蔗糖的ME3+BK+150g/L PEG培养基上桔梗花粉生长最好，培养1.5h后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到97.2%和531.6μm。

表2-6-3　不同浓度蔗糖互作对花粉萌发生长的影响

2.4　 pH对桔梗花粉萌发生长的影响

以ME3+BK+10%蔗糖+150g·L-1 PEG4000为基本培养基，增加酸碱，将此培养基pH值分别调为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。由表2-6-4可见，培养基pH值变化对桔梗花粉萌发和花粉管生长均有显著影响，pH值在4.5～7.0范围内，随pH值的增加，花粉萌发率和花粉管长度均呈“单峰”曲线变化，即在pH值较小时花粉萌发率和花粉管长度随pH的升高而增加，pH 5.5时达到最大，之后开始下降。表明培养基H+浓度过高或过低均不利于桔梗花粉萌发生长。在pH值4.5～7.0范围内，筛选培养基最适pH的基础上，我们又设置pH值为5.4、5.6、5.8三种处理，结果表明pH 5.8为桔梗花粉离体萌发生长的培养基最适酸碱度。

表2-6-4　不同pH值对花粉萌发生长的影响

2.5　温度对桔梗花粉萌发生长的影响

以ME3+BK+10%蔗糖+150g·L-1 PEG4000为培养基，在不同温度条件下桔梗花粉萌发和花粉管生长情况见表2-6-5，可以看出温度对桔梗花粉萌发生长具有显著影响，在20～30℃范围，萌发率和花粉管长度随温度的升高而增大，当温度进一步升高时，花粉萌发率有所下降，生长也减缓;表明桔梗花粉萌发的最适培养温度为30℃，在此温度下培养桔梗花粉萌发率和花粉管长度达到最大值分别为99.7%和654.6μm。

表2-6-5　培养温度对花粉萌发生长的影响

2.6　桔梗花粉生长过程

在ME3+BK+10%蔗糖+150g·L-1 PEG4000培养基上，30℃光培养，桔梗花粉萌发生长情况见图2-6-1。由图2-6-1可见在开始培养的1 h随培养时间的延长桔梗花粉萌发率迅速提高，1.5 h达到最大，之后萌发率不再增加;花粉管长度在初始培养的1.5 h快速生长，之后花粉管生长逐渐停顿。桔梗花粉10min开始萌动，15min花粉管从花粉孔中突出，20min花粉管长度已超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长，1 h多数有活力花粉均已萌发，4 h花粉管生长常交织在一起，花粉管顶端开始膨大，5 h许多花粉管顶端破裂，内容物放出。

图2-6-1　培养时间对花粉萌发率的影响

图2-6-2　花粉管生长情况

1.萌发的花粉;2.生长40min的花粉管;3.生长1 h的花粉管

3　讨论

蔗糖是多数植物花粉离体培养所必需的重要成分，一定浓度的蔗糖可给培养环境提供适宜的渗透压，维持花粉粒内外环境渗透平衡，促进花粉萌发和花粉管良好生长;蔗糖又是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物，参与花粉粒物质能量代谢，为花粉管物质的合成、运输、信号的跨膜转导、传递及其效应实现提供必要的碳源和能量。一些植物花粉在仅含适宜浓度蔗糖的培养基上即可萌发，而多数植物还需添加H3 BO3、Mg2+、Ca2+等花粉萌发诱导和花粉管生长的促进物质。蔗糖浓度也是影响花粉离体萌发和花粉管生长的重要因素，10%～15%的蔗糖可使多数植物花粉良好萌发生长，当蔗糖浓度高于20%时，花粉萌发和花粉管生长受到抑制，且浓度越高抑制也越明显。低浓度蔗糖(≤100g·L-1)对桔梗花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，而高浓度的蔗糖(≥150g·L-1)可明显抑制花粉萌发和花粉管生长，且随着蔗糖浓度的增加，受到抑制程度越明显。

PEG是一种高分子渗透调节物质，能使花粉内膜结构发生变化，改变膜表面电荷，使膜韧性和通透性提高，从而促进花粉萌发和花粉管生长。赵宏波等对梅花、菊花，张涛等对山茶花花粉进行了离体萌发研究，认为适宜浓度的PEG明显促进花粉萌发和花粉管生长。我们发现150～200g·L-1 PEG可以显著促进桔梗花粉离体萌发和花粉管生长，浓度过高或过低促进效果有所减弱，这与赵洪坡、张涛等的研究结果基本一致。

每种植物花粉萌发和花粉管的生长都有自己最适的温度。大多数温带植物花粉萌发和花粉管的生长在25℃以下会受到一定的抑制，25～30℃是最适的萌发温度。肉苁蓉花粉最佳培养温度均为25℃，而棉花花粉培养的适宜温度为20～37℃，黄藤花粉35℃条件下培养6 h可良好萌发生长。同样，培养温度和培养时间对桔梗花粉的萌发和花粉管的生长也有显著影响，在25～40℃条件下培养2～3 h均可使桔梗花粉较好萌发，其中以30℃最佳，培养温度过高不利于花粉萌发生长，培养过长时间花粉管会逐渐破裂，这与黄藤、杏仁、西瓜、玉米、梨、芒果等所报道的结果相符。桔梗在我国各地广泛分布，但主要集中在东北、华北、西北、华中、西南等地，开花季节白天温度多在30℃以上，桔梗花粉在25～40℃温度范围均能较好萌发，而梅花等早春开花植物花粉萌发最佳温度较低，为20℃左右，这是否表明花粉离体萌发生长的适宜温度与其开花传粉季节的环境温度相适应。

4　结论

①PEG可促进桔梗花粉萌发生长，150g·L-1 PEG为最适作用浓度;②100g·L-1的蔗糖有利于花粉萌发和花粉管生长，高浓度蔗糖有明显抑制作用;③桔梗花粉在培养基ME3+BK+10%蔗糖+150g·L-1 PEG(pH 5.8)上培养效果最佳;④25～40℃条件下桔梗花粉均可较好萌发，以30℃培养1.5 h为最佳培养条件。