三疣梭子蟹个野生群体序列分析及系统进化分析

有效地管理、利用和保护三疣梭子蟹的种质资源，以便为今后的优质良种培育提供帮助，对三疣梭子蟹的遗传结构和遗传变异水平进行研究显得尤为重要。第1转录间隔区（internal transcribedspacer1，ITS-1）位于18S rRNA和5.8S rRNA基因之间的非编码间隔区，第2转录间隔区（ITS-2）是介于5.8S和28S rRNA基因之间的非编码间隔区（何毛贤等，2004）。ITS1序列具有较大的变异性、信息量丰富、序列短和易于扩增的特点，在海洋动物系统进化、分类和种质鉴定、遗传多样性研究等方面具有广泛的应用（Kenehington et al，2002；Insua et al，2003；King et al，1999），本研究利用ITS1序列变异来分析4个野生群体的遗传多样性和亲缘关系，以期揭示三疣梭子蟹的遗传多样性水平，为我国的种质保护和生产实践提供基础资料。

实验用野生三疣梭子蟹共60个个体，4个野生群体分别为鸭绿江口野生群体（YL）采自辽宁省鸭绿江口近海、莱州湾野生群体（LZ）采自山东省昌邑市下营港近海、海州湾野生群体（HZ）采自江苏连云港市海州湾近海、舟山野生群体（ZS）采自浙江舟山群岛近海、活体带回实验室后280℃保存备用，提取与检测基因组DNA。ITS1序列PCR扩增正向引物为：59-GTAACAAGGTTTCCGTAG GTG-39，反向引物为：59-TTGCTGCGGTCTTCATCG-39。由上海生工生物工程技术有限公司合成。将测得的序列用Bioedit软件进行编辑并辅以人工核查，用ClustalX1.83软件比对，并确定序列长度。用DnaSp5.0软件计算各个群体的单倍型，单倍型多态性，多态位点数，平均核苷酸差异数，核苷酸多样性指数，用SSRHunter3.1软件查找简单重复序列，用Arlequin3.1（Excoffier et al，2005）中的分子变异分析（AMOVA）方法估算遗传变异在群体内和群体间的分布及遗传分化系数（F-statistics，Fst），计算并用排列测验法（permutation test）检验Fst的显著性（重复次数为1000）。MEGA4.0软件计算序列的碱基组成、变异位点、简约信息位点、转换/颠换、不同群体间的Kimura2-paramter遗传距离，用邻接法（NJ）构建系统树，系统树各结点的支持率以序列数据集1 000次重复抽样检验的自引导值（Bootstrap value）表示。