生物氧化的电子传递实验

实验五　生物氧化的电子传递实验

【实验目的】

1．掌握电子在电子传递链中的传递过程。

2．了解体外实验中研究电子传递链的方法。

【实验原理】

生物氧化过程中代谢物脱下的氢由NAD⁺或FAD接受生成还原型NADH或FADH₂，再经一系列电子传递体传递，最后与氧结合生成水。这些存在于线粒体内膜上的氧化还原酶及其辅酶依次排列，顺序地起传递电子或电子和质子的作用，称为电子传递链或呼吸链。

在体内，代谢中间产物琥珀酸在线粒体琥珀酸脱氢酶(辅酶FAD)的作用下脱氢氧化生成延胡索酸，脱下的氢使FAD还原成FADH₂，再经电子传递链传递，即FADH₂→Q→细胞色素(b→c1→c→aa3)，最后与氧结合生成水。在体外实验中，组织细胞生物氧化生成琥珀酸的量可采用在琥珀酸脱氢时伴有颜色变化的化合物作氢受体来研究。

本实验以2，6-二氯酚锭酚(DPI)为氢受体，蓝色的DPI从还原型黄素蛋白(FADH₂)接受电子，生成无色的还原型DPI·2H，蓝色消失，其反应过程如下:

琥珀酸+FAD→延胡索酸+FADH₂

DPI(蓝色)+FADH₂→DPI·2H(无色)+FAD

根据褪色时间可测定生物氧化过程中各代谢物与琥珀酸之间在代谢途径中的距离。

【实验材料】

猪心。

【实验器材】

绞肉机、纱布、细砂、研钵、冰浴、恒温水浴等。

【药品试剂】

1．磷酸钾缓冲溶液(PBS，50 mmol/L，pH7．4):0．2 mol/L磷酸二氢钾溶液500 ml和0．2 mol/L氢氧化钠溶液395 ml混合加水至2000 ml。

2．1．5 mmol/L 2，6-二氯酚锭酚:溶解在PBS溶液中。

3．90 mmol/L葡萄糖溶液:溶解在PBS溶液中。

4．90 mmol/L琥珀酸溶液:溶解在PBS溶液中。

5．90 mmol/L乳酸溶液:溶解在PBS溶液中。

6．5 mmol/L NAD+:溶解在PBS溶液中。

【实验方法】

1．心肌提取液的制备:称取绞碎的心肌糜3 g，置于250 ml烧杯中，加冰冷的去离子水200 ml，搅拌1分钟，静置1分钟，小心倾去水层，同法洗涤3次后，以细纱布过滤并轻轻挤压除去过多液体。将肉糜转移至冰冷的研钵中，加等量细砂和5 ml PBS，在冰浴中研磨至糊状，再加15 ml PBS，抽提(至少5分钟)，双层纱布过滤，滤液收集于试管，置冰浴中备用。

2．底物的氧化:取6支试管编号，按表5-8依次加入各试剂(单位ml)。

表5-8　　　　　　　琥珀酸脱氢酶催化的电子传递实验

将试管摇匀后于37℃中保温5分钟，加入已经37℃水浴预保温5分钟的心肌提取液各1 ml，混匀并继续保温。

3．观察结果:观察各管颜色变化，记录各管褪色时间，30分钟不褪色者记为不褪色。分析实验结果所说明的问题。

【注意事项】

1．无色(还原型)DPI·2H与氧接触可重新氧化成蓝色的(氧化型)DPI，所以观察本实验结果时切勿振摇试管。

2．体外实验亦可用甲烯蓝作为受氢体，在类似实验条件下蓝色的甲烯蓝(氧化型)受氢还原成无色甲烯蓝(还原型)。