二、获得性免疫缺陷病的抗体检测
AIDS的实验室检查包括血清中抗-HIV抗体、HIV抗原、HIV核酸以及淋巴细胞尤其是CD4+T淋巴细胞的数量的检测，其中最为常用的是抗-HIV抗体检测，分为初筛试验和确诊试验两个步骤。
（一）初筛试验
目前常最为用的标准初筛试验为ELISA。
【原理】
采用间接ELISA或双抗原夹心ELISA。用基因工程或人工合成的HIV-1和HIV-2多肽抗原合理地组合（如HIV-1 gp4l，HIV-1 gp24，HIV-2 gp36）包被反应板微孔，若待测血清中存在抗-HIV抗体，则与固相抗原结合，洗去未反应物，再加酶标记的抗人IgG（双抗原夹心法采用的是酶标记HIV多肽抗原组合）使酶底物显色。显色程度与待测血清中的抗-HIV抗体水平呈正比。
【试剂与器材】
（1）筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准，批检合格，临床评估质量优良，在有效期内的试剂。
（2）酶标仪、微量移液器、吸水纸等。
【操作方法】
具体方法参照各种试剂盒的说明书，一般步骤如下：
（1）试剂自冰箱取出后恢复至室温，取出已包被HIV抗原的微孔反应板，分别将已稀释的阴性对照、阳性对照和待测血清加入微孔，每孔100μL，37℃温育1 h。
（2）甩尽孔内液体，将洗涤液注满各孔，洗涤5次。
（3）每孔加最适浓度的酶标记抗人IgG抗体（或酶标记HIV多肽抗原组合）100μL，37℃温育1 h，同上洗涤5次。
（4）每孔加酶底物溶液100μL，室温避光反应30 min。
（5）每孔加入终止液（2 mol/L H2SO4）50μL，30 min内于酶标仪450 nm波长测吸光度A值。
【结果判断】
以P/N≥2.1为阳性。有的试剂盒是以待测标本A值≥CO值为阳性（CO值=阴性对照平均A值+0.1）。
【注意事项】
（1）严格按照试剂盒说明书操作，不得擅自更改。
（2）待测血清应在采集后即时检测，否则应置-20℃冻存（不宜超过l周）。在4℃保存时，超过48 h会使一些弱阳性标本转为阴性。
（3）实验操作中洗涤应彻底，以避免假阳性结果发生。
（4）防止交叉污染。在检测前，所有标本均应视为“阳性”标本即生物危险品。
（5）检测对象如为高丙种球蛋白血症、自身免疫病和某些肿瘤患者，血样污染，待测血清反复冻融或有免疫复合物存在均可造成假阳性结果。
【临床应用】
抗-HIV抗体检测的特异性强、敏感性高，方法简便、成熟，而且在HIV感染后除早期短暂的“窗口期”外，长期稳定地存在并可被检测到，适用于初筛检测，凡初筛结果阳性者，需要进一步确证。
（二）确证试验
确证试验方法有免疫印迹技术、放射免疫沉淀技术及间接免疫荧光技术等。其中免疫印迹技术敏感性高、特异性好，是目前最常用的抗-HIV抗体确证试验，其流程见图10-1。
图10-1 抗-HIV抗体确证试验流程
【原理】
先将HIV蛋白质抗原裂解，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离各抗原组分，形成按相对分子质量大小依序排列的区带，再转印至NC膜上，加待测血清与NC膜反应，如血清中有抗-HIV抗体，则可与膜条上对应的抗原结合，加入酶标记抗人IgG反应后，再加入酶底物显色，膜条上出现呈色的特异性条带，而无关的抗原条带不呈色。
【试剂与器材】
（1）此试验在艾滋病确认实验室进行，使用经国家食品药品监督管理局注册批准、检查合格、在有效期内的试剂。
（2）待测血清、质控血清。
（3）温箱、小型摇床、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。
【操作方法】
具体方法参照各种试剂盒的说明书，一般步骤如下：
（1）自冰箱取出试剂盒，恢复至室温，配制所需试剂。
（2）将已转印HIV抗原的NC膜自试剂盒中取出，置反应槽中，加3 mL洗涤液，室温振荡5 min。
（3）加入30μL待测血清，同时设阴性、阳性对照，室温中振荡30 min。
（4）吸弃槽内液体，加5 mL洗涤液，室温振荡5 min。此步骤重复1次。
（5）吸弃槽内液体，加3 mL酶标记抗人IgG抗体，室温振荡30 min。
（6）重复步骤4。
（7）吸弃槽内液体，加3 mL酶底物溶液（含稳定剂DONS），室温振荡10 min。
（8）吸弃槽内液体，加5 mL蒸馏水，室温振荡5 min。再用DONS水溶液浸膜。此步骤重复2次。
（9）移膜片至滤纸上，观察结果。
【结果判断】
检测结果的判断是根据呈色条带的种类和多少，与试剂盒提供的阳性标准比较，并按试剂盒说明书的规定综合判断。一般判定标准如下：
（1）抗-HIV抗体阳性（+），有下列任何一项阳性即可确认。①至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现。②至少有l条env带和p24带同时出现。
（2）抗-HIV-2抗体阳性（+），同时符合以下两条标准即可确认。①符合WHO阳性判定标准，即出现至少两条env带（gp36和gp140/gplO5）。②符合试剂盒提供的阳性判定标准。
（3）抗-HIV抗体阴性（-） 无抗-HIV抗体特异带出现。
（4）抗-HIV抗体不确定（±） 出现抗-HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。
【注意事项】
（1）只有经上级主管部门批准的确认实验室才能进行确证试验。
（2）待测血清应在采集后即时检测，否则应置-20℃冻存（不宜超过l周）。在4℃时保存，超过48 h会使一些弱阳性标本转为阴性。
（3）不同试剂盒对抗-HIV抗体测定的敏感性不同，故有的试剂盒在待测血清与NC膜反应时，应过夜温育。
【临床应用】
抗-HIV抗体阳性提示如下：
（1）感染了HIV，可作为传染源将HIV传播他人。
（2）18个月的婴儿除外，5年之内将有10％～30％的人发展为艾滋病。
（3）对抗-HIV阳性的母亲所生的婴儿，如18个月内检测血清抗-HIV阳性，不能诊断为HIV感染，尚需进行抗体HIV核酸检测或18个月后的血清抗体检测来判断。
知识与技能拓展
ToRCH的由来
ToRCH是引起围产期感染的一组病原体的英文名称的字头组合，“To”即Toxoplasma（弓形虫），“R”即Rubevirus（风疹病毒），“C”即Cytomegalovirus（巨细胞病毒），“H”即Herpesvirus hominis（单纯疱疹病毒）。这组病原体常导致胎儿宫内感染，造成致流产、死胎、胎儿畸形，或出现婴儿智力低下、视听障碍等远期严重后果。为引起围产医学家和优生优育学家的关注，人们将这几种病原体组合在一起，以ToRCH（Torch，火炬）命名，并列为产前检查的重点监测项目。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
