与抗菌药物治疗有关的实验室检查

第三节　与抗菌药物治疗有关的实验室检查

一、药物敏感性试验

测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制或杀灭作用的方法称为药物敏感性试验（药敏试验）。药敏试验结果对于临床选用抗菌药物具有重要参考价值。每个医院都应对本院临床分离菌进行药物敏感性监测，了解临床细菌的耐药性变迁情况，指导抗菌药物的选用，并为制订药物研制、生产、分配等计划提供依据。

1.药敏试验方法　主要有扩散法和稀释法。

（1）稀释法：以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列对倍稀释，经培养后肉眼观察其最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），即抑制细菌生长所需药物的最低浓度。根据实验所得MIC和该药在常用剂量时体液内能够达到的浓度，判定对该药敏感、中介或耐药。通常也以MIC₅₀和MIC₉₀来表示一批实验中某种抗菌药物抑制50%和90%受试菌生长所需的MIC。“临界浓度”（break points）即根据抗菌药物抑制细菌生长所需要的MIC结合常用剂量时对该菌在人体内所能达到的血药浓度划分细菌对各种抗菌药物敏感和耐药的界限。统计在临界浓度时该药抑制受试菌株的百分率，称为抑菌率，亦可称为细菌对该药物的敏感率，常用于临床流行病学和细菌耐药性调查。通常以最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）为杀灭细菌的标准，即抗菌药物使试验菌最初的活菌总数减少99.9%或以上所需要的最低抗菌药物浓度。

本方法中用肉汤培养基者称为肉汤稀释法，用琼脂培养基者称为琼脂稀释法。根据同样原理和步骤在微孔板上进行肉汤稀释法，过夜培养后肉眼观察每个孔内肉汤浊度，判定最低抑菌浓度，称为微量稀释法。用肉汤稀释法时将无细菌生长管分别移种于不含抗菌药物的血平板，过夜培养后菌落数不超过5个的血平板中所含最低药物浓度即为该药的MBC。琼脂稀释法适用于需同时进行大量菌株的药敏测定，实验结果容易判定、重复性好。缺点是不能继续进行最低杀菌浓度的测定。

（2）扩散法（即纸片法）：将含有一定量抗菌药物的纸片贴在涂有标准菌量的琼脂平板上（一般推荐用Mueller-Hinton琼脂）过夜培养。由于抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制，产生抑菌圈，其直径与药物对细菌的最低抑菌浓度呈反比。量取抑菌圈直径，可以判断该菌对某药敏感、中介或耐药。目前常用Kirby-Bauer（K-B）法，适用于需氧菌和兼性厌氧菌的药敏测定。

（3）E测定法（Epsilometer test）：在琼脂扩散法的基础上改良而成，方法是将抗菌药物置于5mm×50mm的不透明薄型塑料带上，其浓度按log2梯度递减，共含15个不同浓度的药物，塑料带反面是相应的药物浓度标志。此塑料带代替抗生素纸片，其余操作步骤与琼脂扩散法同。过夜培养后在塑料带周围形成的抑菌圈边缘与塑料带相交处的药浓度，即该药对细菌的MIC。本法适用于普通细菌和营养要求高、生长缓慢或需要特殊培养条件的病原菌的药敏检测。

（4）结果判断及临床意义：通常采用美国临床实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2005年由NCCLS更名而来）颁布的标准，来判断药敏结果，分为敏感、中介和耐药。抗菌药物在临床常用量时达到的稳态血浓度超过对细菌MIC的2～5倍以上者为敏感；当细菌引起的感染仅在应用大剂量抗菌药物时才有效者，此种细菌对该药的敏感性为中介，这时常规用药后的稳态血浓度仅相当于或略高于对细菌的MIC。药物在血清或体液中的浓度低于药物对细菌的MIC时，该细菌为耐药。

2.联合药敏试验　对于严重感染或混合感染的病人常需采用两种抗菌药物联合治疗。抗菌药物联合时可产生协同、相加、无关或拮抗作用。因此，有必要进行联合药敏试验，供选用药物的参考。无关作用指两药合用时总的作用不超过联合中作用较强者；两种药物联合的结果相当于两者作用相加的总和时称为相加作用；如合用所得结果较相加者为好，称为协同作用；如合用的结果反较两者之中作用较强者为差，则为拮抗；拮抗作用最少见。

测定联合药敏的方法有：①纸片法：又分单药纸片法、复合药物纸片法等，根据抑菌圈的大小、形状判断结果；②棋盘法：又可分肉汤稀释法和琼脂稀释法。先测定两种药物单独对受试菌的MIC，然后以高于和低于MIC的不同浓度分别进行联合，所得结果计算FIC（fractional inhibitory concentration）作为联合药敏试验结果的判断依据。

注：FIC指数≤0.5为协同作用；＞0.5～1为相加作用；＞1～2为无关作用；＞2为拮抗作用。

3.血清杀菌滴度　原理和方法与肉汤稀释法药敏试验相同，感染性疾病患者经抗菌药物治疗后，抽取患者血药峰浓度时的血清与从患者分离所得病原菌进行药敏试验。患者血清能抑制细菌生长的最大稀释度即血清杀菌滴度。一般认为血清杀菌滴度在1∶8以上者预示治疗有效，在1∶4以下者则治疗有可能失败。据报道，本试验对严重感染患者，如感染性心内膜炎或粒细胞减少合并败血症患者的预后，有较大参考意义。但进行本试验必须获得病原菌。

二、耐药菌的检测

1.细菌β-内酰胺酶测定　许多致病菌能产生β-内酰胺酶，水解青霉素类和头孢菌素类结构中的β-内酰胺环而使之失去抗菌活性，如产β-内酰胺酶的嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和卡他莫拉菌对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药；产β-内酰胺酶金葡菌可对青霉素耐药；因此，在对细菌进行药敏试验的同时检测β-内酰胺酶，对于选用药物有重要的参考意义。CLSI推荐采用产色头孢菌素（头孢硝噻吩）法进行快速测定，适用于金葡菌、肠球菌属、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和淋病奈瑟菌中β-内酰胺酶的检测。

目前大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌的部分菌株可产生超广谱β-内酰胺酶（extended spectrumβ-lactamases，ESBLs）。CLSI推荐采用第三代头孢菌素药敏的筛选试验和酶抑制增强试验来检测产ESBLs菌株。临床如遇超广谱β-内酰胺酶产生株，均应视作该菌对所有β-内酰胺类抗生素（碳青霉烯类和头霉素类除外）耐药。此外，产β-内酰胺酶菌株也常对氨基糖苷类、氟喹诺酮类耐药，给临床治疗带来很大的困难。多数超广谱β-内酰胺酶可为克拉维酸等酶抑制剂所抑制。目前，临床上对产超广谱β-内酰胺酶菌所致感染的治疗可根据病情以及药敏试验的结果合理选用哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦等酶抑制剂和β-内酰胺类的复方制剂，或头霉素类或碳青霉烯类等抗菌药物。

2.重要耐药菌的检测

（1）耐甲氧西林葡萄球菌的检测：目前已知葡萄球菌属的大多数菌株可产青霉素酶，金葡菌中约有90%或以上的菌株产生青霉素酶，凝固酶阴性葡萄球菌中亦有约85%以上的菌株产生青霉素酶，故目前青霉素已不用于治疗葡萄球菌感染。在葡萄球菌中有一类菌株携带编码青霉素结合蛋白PBP2a的mecA基因，使该菌株对β-内酰胺类抗生素的亲和力显著降低，导致其对甲氧西林、苯唑西林，以及所有青霉素类、头孢菌素类等β-内酰胺类抗生素耐药。因此，对甲氧西林耐药的金葡菌称为MRSA（methicillin-resistant staphylococcus areus），凝固酶阴性葡萄球菌中的甲氧西林耐药株称MRCNS（methicillin-resistant coagulase negative staphylococcus），而对甲氧西林敏感的上述葡萄球菌分别称为MSSA和MSCNS。两类葡萄球菌引起感染的治疗药物不同，因此临床微生物实验室的正确报告对临床合理选用抗菌药物十分重要。目前CLSI推荐临床微生物实验室常规采用每片30μg头孢西丁纸片出现的抑菌圈直径≤21mm者即是MRSA，抑菌圈直径≤24mm者即为MRCNS。如果当临床微生物实验室报告确证为MRS菌株时均应视作对所有β-内酰胺类抗生素耐药，即使体外药敏试验对头孢菌素、酶抑制剂复方以及碳青霉烯类显示敏感，但临床治疗往往失败，需根据细菌药敏选用万古霉素等糖肽类、利奈唑胺等抗菌药物治疗。如果是葡萄球菌属中的MSS菌株（MSSA和MSCNS）对苯唑西林、氯唑西林等耐酶青霉素、第一代头孢菌素和β-内酰胺酶抑制剂复方等仍多数敏感。

（2）VRE和HLARE肠球菌的检测：CLSI推荐临床微生物实验室应常规采用每片30μg的万古霉素纸片进行检测，抑菌圈直径≤14mm者则为万古霉素耐药菌株（vancomycin resistant enterococcus，VRE）。该类菌株具有VanA、VanB、VanC等6种与肠球菌对万古霉素耐药性相关的耐药基因型，对糖肽类中的万古霉素和替考拉宁显示不同程度的耐药性。因此当临床微生物实验室的报告为VRE菌株时，特别是VanA型VRE菌株，目前有效的治疗药物很少，治疗十分困难，可进一步进行氯霉素、红霉素、利福平、四环素等药物的敏感性试验；VanB型的VRE菌株，通常对替考拉宁敏感，VanC型VRE菌株在临床上少见。同时CLSI还推荐采用每片120μg庆大霉素纸片，抑菌圈直径≤6mm者为高水平氨基糖苷类耐药菌株（high-leval aminoglycoside resistant enterococcus）。某些菌株并可产生一种质粒介导的双功能氨基糖苷类钝化酶AAC（6′）-APH（2″），导致细菌对青霉素类或糖肽类联合氨基糖苷类无协同抗菌作用。

（3）耐青霉素肺炎链球菌的检测：CLSI推荐用每片1μg苯唑西林纸片筛选耐青霉素肺炎链球菌，当抑菌圈直径≤19mm者则必须用稀释法进行青霉素的MIC测定。如青霉素的MIC≤0.06μg/ml者为青霉素敏感肺炎链球菌（penicillin-susceptible streptococcus pneumoniae，PSSP）；MIC为0.125～1ug/ml者为青霉素中介肺炎链球菌（penicillin-intermediate streptococcus pneumoniae，PISP），亦称青霉素低度耐药株；MIC为≥2μg/ml者为青霉素耐药肺炎链球菌（penicillin-resistant streptococcus pneumoniae，PRSP）。其中后两者统称青霉素不敏感肺炎链球菌（penicillin-nonsusceptible streptococcus pneumonia，PNSP）。PSSP所致的感染仍可采用青霉素、阿莫西林等治疗。PISP对头孢氨苄、红霉素、克林霉素、复方磺胺甲唑等的耐药率可达40%～80%；但对第二和第三代头孢菌素、氟喹诺酮类和万古霉素等仍可呈现敏感，对阿莫西林等的敏感性下降。PISP感染可选用头孢菌素类，或高剂量阿莫西林。PRSP对青霉素耐药并非由于青霉素酶引起，因此宜根据药敏试验结果选用抗菌药。

（朱德妹）