一、实验目的
熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。
二、实验原理
叶绿素存在于果蔬、竹叶等绿色植物中。叶绿素在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体，当细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光或热较敏感。在酸性条件下生成叶褐色脱镁叶绿素，加热可使反应加速;在稀碱液中可水解为叶绿酸(鲜绿色、叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有a、b两种，两者都易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿中。
叶绿素的含量测定方法多种，其中有:
(1)原子吸收光谱法:测定镁含量，可以间接算出叶绿素含量。
(2)分光光度法:测定叶绿素提取液的最大吸收波长的光密度，然后通过公式计算获得叶绿素含量数据。此法快速、简便。其原理如下:
叶绿素a、叶绿素b对645nm和663nm波长的光有吸收高峰，且两吸收曲线相交于652nm处。因此，测定提取液在645nm、663nm、652nm波长下的光密度，并根据经验公式计算，可分别得到叶绿素含量数据。
如果只要求测定总叶绿素含量，则只需要测定一定浓度提取液在652nm波长的光密度。其总叶绿素含量按下式计算:
式中:OD——表示在所指定波长下，叶绿素提取液的光密度值;
V——为叶绿素丙酮提取液的最终体积(mL);
W——为所用果蔬组织鲜重(g)。
三、实验材料、仪器与试剂
(1)材料:绿叶青菜、水果。
(2)仪器:研钵、100mL容量瓶、滤纸、分光光度计、离心机、分析天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管
(3)试剂:石英砂(或碳酸钙)、丙酮。
四、实验步骤
1．叶绿素提取及含量测定
称取青菜样品5g于研钵中，加少许石英砂(约0．5～1g)并充分研磨后倒入100mL容量瓶中，然后用丙酮分几次洗涤研钵并倒入容量瓶中，用丙酮定容至100mL;充分振摇后，用滤纸过滤。取滤液用分光光度计分别于645nm、663nm和652nm波长下测定其光密度值，以95%丙酮作空白对照。将测定记录数据列表，按照公式分别计算青菜组织中叶绿素a、b和总叶绿素含量。
2．叶绿素在酸碱介质中稳定性实验
分别取10mL叶绿素提取液，滴加0．1mL盐酸和0．1mLNaOH溶液，观察提取液的颜色变化情况，并记录下颜色变化时的pH值。
五、注意事项
(1)所计算出的叶绿素含量单位为mg/g鲜重。这一单位有时太小，使用不方便，可乘1000倍，变为μg/g鲜重单位。
(2)由于叶菜类蔬菜中含有水分，可先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似95%。
(3)若以水果为材料，因叶绿素只存在于表皮中，取样时用锋利剖刀在其表面轻轻将表皮削下，然后称取0．5g样品研磨，加水5mL充分研磨，然后用丙酮洗涤，定容至100mL，为95%丙酮提取液。
(4)使用分光光度计调零时必须用95%丙酮。
六、思考题
(1)测定叶绿素含量实验中，使用分光光度计应注意哪些问题?
(2)叶绿素在酸碱介质中稳定性如何?
(3)试说明日常生活中炒青菜时，若烧煮时间过长青菜容易变黄，试分析其原因?在青菜深加工中如何保持其颜色?
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