转基因育种技术

植物（作物）转基因育种技术已经在棉花、烟草、番茄、大豆、玉米、水稻等主要粮食作物及经济作物上成功应用。包括感光型杂交水稻内的水稻转基因育种将是未来的主要育种手段，因此，转基因育种技术将迅速成为水稻育种关键技术之一。感光型杂交水稻转基因育种技术的关键在于寻找符合育种目标要求的目的基因；大承载量的高效转导载体；高感染率、高分化绿苗率、综合农艺性状好且高产的受体。目前，水稻转基因技术最成功的方法有两种。一是农杆菌介导法。借Ti质粒的T-DNA把外源DNA（目的基因）转导到受体基因组中。二是基因枪法。通过高压放电、高压气体或火药爆炸作动力，通过载有外源基因的金粉或钨粉微粒轰击受体植物（作物）的悬浮细胞、愈伤组织或胚等，实现外源基因的转移。

1.目的基因、受体的准备

目前，我国作物转基因育种在生产上应用最成功的是转Bt基因抗虫棉，转基因抗虫水稻已经转导成功，但尚未大面积推广应用。对于感光型杂交水稻新组合的转基因育种来说，目前目的基因和受体的主要来源有：①已知的目的基因，如水稻抗虫基因育种主要集中在两类基因，一类是苏云金杆菌杀虫结晶蛋白Bt基因，包括CryⅠA （a）、CryⅠA（b）、CryⅠA（c）、CryⅡA等，可杀死鳞翅目昆虫；另一类是雪花莲凝集素GNA基因，可抗刺吸式昆虫如褐飞虱等，以及抗花叶病毒基因、抗除草剂基因等。②来自粮食作物及稻种资源的高产基因，如野生稻的高产潜力基因、QTL基因、抗病虫基因、抗稻瘟病基因、抗白叶枯病基因、抗褐飞虱基因、抗白背飞虱基因等。③来自其他生物的基因，主要为来自微生物的基因。

（1）目的基因的准备

按基因克隆技术规程操作进行，把目的基因从基因文库中提取出来，在无菌条件下繁殖菌液备用。目前，已经获得外源基因表达的转基因水稻植株见表5-3。

（2）受体准备

目前采用的水稻转基因方法无论是农杆菌法还是基因枪法，都要以受体的细胞悬浮液、愈生组织或胚作为直接接受载体感染或轰击的受体。因此，在准备前需要适当选择愈生组织诱导率高、绿苗分化率也高的水稻品种作为受体品种。当然，作为选择目标，首先应该选用符合育种目标要求的品种或不育系、恢复系、保持系作为受体，才能获得优良组合。因此，受体准备工作分两部分，一是受体品种的种子准备，二是培养受体植株无菌苗的准备。无菌苗的获得需要做培养基的配制消毒、接种室的消毒、无菌条件下接种、培养室的准备等一系列的准备工作。在确定受体品种后，在培养室无菌状态下，经过消毒后将其接种于事先准备好的培养基中进行培养，使之成为无菌健康受体种苗，为转导做好准备。一般情况下，无菌苗长到15~20 cm时，可以取材进行目的基因重组体的转导实验。

表5-3  转导有益性状基因水稻（袁隆平，2010）

续表

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2.基因分子重组（三菌结合）

采用农杆菌法进行外源目的基因转导，首先，需要把带有目的基因如插入卫星c DNA的ROK2质粒的E. coli Mc 1022与中间载体结合，即带有标记基因（报道基因）PRK2013的E. coli HB101接种于LB培养液中37℃摇床培养过夜。表达载体如PAL4404农杆菌也接种于LB培养液中，30℃/24小时。然后通过涂布培养，获得纯化的三菌结合的克隆作转化用。

3.目的基因转导

植物转基因的受体细胞转化主要采用三种方法：①叶圆片法。采用无菌的受体植株叶片，在无菌条件下，用直径1 cm的打孔器把叶片打成小圆片，再浸入基因载体菌液中进行转化。②愈伤组织法。事先将受体器官培养出愈伤组织，再用载体菌液浸泡转化。③原生质体法。把受体组织细胞做成原生质体再用载体菌液转化。其中叶圆片法操作最简单。

4.标记基因（报道基因）筛选

把经过转化的受体组织（叶圆片、愈伤组织、原生质体）接种到带有标记基因（报道基因）产物筛选的培养基中，分化绿苗，并在分化绿苗的同时达到筛选的目的。如果是不带标记基因的受体组织是不能在选择培养基中分化出绿苗的，也不能长久存活。这样的操作实际上起到去除非目的基因转化细胞组织及其可能产生的绿苗的作用。

5.转导受体细胞愈伤组织的分化

经过标记基因的筛选后，应及早把转导后的受体愈伤组织转移到分化培养基上进行绿苗分化培养以获得转基因绿苗。只有获得转基因绿苗才能进行育种利用，因此转基因愈伤组织的分化培养极其重要。根据一般的植物组织培养经验，分化培养基配方至关重要。不同的培养基配方成分得到的绿苗分化率有很大的差异，有的培养基配方会出现全部白化苗的状况。因此，选用良好的配方可以有效地提高转基因绿苗的获得率，提高转导效率。对于籼型杂交水稻组合可以使用V5等培养基，配合适量的生长激素能够提高绿苗分化率；对于粳型杂交水稻组合可以使用N6等配方；对于含有野生稻基因的受体可采用YD、YC5等基本培养基配方进行转导后愈伤组织的分化培养。培养条件与花药培养的条件相同，即每天在1 500 lx的荧光灯下照16小时，温度25℃±1℃，空气湿度65%的条件静置光培养，直至愈伤组织分化出根、茎、叶形成幼苗。

6.分化植株的目的基因监测

获得目的基因转导植株后应进行目的基因的检测，找出目的基因的片段，证实转基因成功与否。实验程序：取转基因植株叶片，提取DNA，然后进行目的基因的PCR扩增，电泳找出目的基因条带。没有检测到目的基因的植株，不是转基因植株，也难以达到转基因育种的目标要求。

7.分化植株目的基因表达的农艺性状（抗性）鉴定

在检测到目的基因的植株中进行目的基因表达的农业性状（包含各种抗性、优良农艺性状如叶片挺直、半卷型叶片、优质性状如蛋白质含量、支链淀粉含量等与目的基因表达有关的物质证据。例如转导抗稻瘟病的抗性基因，就一定需要进行各个时期的稻瘟抗性鉴定；如果是转导Xa21基因或Xa23基因，就要进行白叶枯病抗性鉴定）。检测方法采用国家农业行业的水稻主要病虫害检测规范和水稻种质资源鉴定技术规程的技术标准进行，筛选出优良的转基因株系。

8.目的基因株系的评比试验

获得转基因株系后，应参加水稻新株系品比试验，从单株农艺性状到小区群体生长表现情况，特别是株系的稻谷产量、大米品质等进行系统全面的品比，筛选出优中更优的株系繁殖为新组合（品种）。

9.带目的基因的优良品系的基因安全评价

获得稳定的优良转基因株系后，应及时向农业部主管部门申请转基因品种（组合）的基因安全鉴定评价。经过安全评价试验后，才能获得国家转基因品种（组合）的生产许可证书，进行生产上的推广应用。

10.目的基因优良品种区域试验

经过品比试验的优选后入选的新组合（品种），可以进行地方省级（自治区级）或国家级区域新品种（新组合）比较试验，经过3年多点试验能够入选的品种（组合）可以获得地方或国家新品种审定证书，获得新品种生产应用的资格。目前，由于转基因作物品种的生产应用比较慎重，特别是对粮食作物的转基因品种生产慎之又慎，所以放开进入区域试验、生产应用尚需时日。

11.通过审定的目的基因优良组合生产试种示范和生产应用

获得地方或国家品种审定证书的新品种可以进行生产试种示范和推广应用。为了加快新品种的推广进程，育种者都会采用多点同期进行试种示范工作，把新品种的种子发放给有关公司、有关县（区、市）农业局推广站，通过他们进行推广应用工作。育种者可选择在适当时机分区域召开试种示范会议，邀请有关公司领导及分管农业生产的领导到会参观评议，选出最适合当地应用的品种。

转基因技术研究的深入发展将进一步应用到植物基因组研究的成果，从基因组研究发现的各种基因结构和序列中寻求更多的目的基因用于转基因育种。最值得关注的是基因图谱及功能结合的研究。在高等植物中构建了DNA分子标记连锁图谱后，很快就将其应用于重要农艺性状的QTL研究，并于1988年发表了高等植物的第一篇QTL研究报道（Paterson et al.，1988）。此后，QTL分析一直成为基因组研究的重要方向。随着研究发展的逐步深化，从最初的单基因水平为主，发展到单基因与多基因并重的局面；从针对最终表型的静态定位发展到针对发育过程不同时期性状表现的动态定位；从针对单一类型性状研究发展到重视相关性状的综合研究。早期的作物QTL研究基本上局限于全基因组扫描的QTL初定位，到了20世纪90年代后期，开展研究较早、基因组研究进展较快的作物已经开始进入QTL精细定位和图位克隆这一新的领域，取得许多新成果（Frary et al.，2000；Yano et al.，2000）。

水稻是开展QTL研究最早的和最广泛的植物物种之一，也是QTL研究进展最快的植物物种之一。到2006年底，Gramene数据库（www. gramene. org）已经收录了8 129个水稻的QTL，并按性状类别分为产量（yield）、生活力（vigor）、育性（sterility or fertility）、品质（quality）、发育（development）、生物胁迫（biotic stress）、非生物胁迫（abiotic stress）、生化（biochemical）、形态学（anatomy）9个性状类型，见表5-4。自20世纪90年代末开始，已经应用图位法克隆了控制水稻抽穗期、实粒数、粒长、落粒性、耐盐性和再生能力等形状的QTL。

今后的弱感光及感光型三系杂交水稻的转基因育种，必须关注水稻及作物基因组研究的进展，从基因组研究中发现新的功能基因和调控基因（启动子、操纵子、终止子等），引用作为新的不育系、恢复系、保持系以及新组合育种的目的基因。

表5-4  至2006年底Gramene数据库收录的QTL数（程式华，2010）

注：其他作物包括水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、大麦（Hordeum vulgare）、燕麦（Avena sativa）、小麦（Tritticum aestivum）、四倍体小麦（Tritticum turgidum）、珍珠稷（Pennisetum glaucum）、谷子（Setaria italica）、沼生菰（Zizania palustris）。

综上所述，感光型杂交水稻育种技术关键主要集中在育种目标的精准确定、育种技术及技术路线和杂交后代的正确选择。三者连成一个育种技术系统，缺一不可。