组织培养过程中，即使每个过程都按规范操作，也会发生一些问题，常见的是污染、褐变和玻璃化，这3个问题并称为组织培养的三大难题。
一、污 染
（一）污染现象
污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。组织培养中污染的病原体主要是细菌、真菌污染。细菌污染（见图4-2）的特点是菌斑呈黏液状物，有臭味，在接种后1～2 d即可发现；真菌污染（见图4-3）的特点是污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10 d才能发现。
图4-2 细菌污染
图4-3 真菌污染
（二）原 因
1.外植体带菌
其原因是原瓶苗有污染，外植体消毒不彻底。通常多年生的木本材料比1～2年生的草本材料带菌多；老的材料比嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多；带泥土的材料比清洁的带菌多；阴雨天采集的材料易带菌；一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。
2.培养基带菌
高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况，以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。此外，培养瓶瓶盖松动、培养基存放时间太长都可能导致染菌。
3.操作环节
接种室不清洁、不干燥、不密封，接种室不经常用紫外线灯照射、甲醛熏蒸、70%的酒精喷雾杀菌，超净工作台不杀菌，风机不打开，操作过程不规范、不熟练，经常走动，在操作时说话等都可能导致染菌。
4.培养环境
培养室要求清洁、密闭，每天用70%的酒精喷雾除菌、降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌，如有空气过滤装置效果更好。培养室相对湿度太高时，污染加重。
（三）预防措施
1.接种室的灭菌
在每次接种前30 min，用 20% 的新洁尔灭擦洗室内设备、工作台面，再用紫外线灯照射20 min。使用前还可以喷洒 70% 的酒精，使空气中灰尘迅速下降。若有污染的材料不可以就地清洗，必须高压灭菌后再清洗，否则会导致大量孢子弥漫。加强环境的灭菌消毒，要及时打扫卫生，定期蒸熏消毒，保证环境的干净。
2.操作规范
在进行组织培养时，一定保证培养基灭菌彻底，器皿和用具一定消毒彻底，保证无菌，同时在接种时还需要严格进行无菌操作。接种时接种人员的手、手腕要用酒精棉球好好擦拭，并且要求接种人员的技术娴熟、干练。
3.外植体选择与消毒
由于不同种类的植物材料，不同的取材部位、取材大小、取材年龄以及取材周期，其带菌量不同，为此在取材时应仔细选择，以减少污染的发生。一般在春季采集生长健壮的材料为佳，在连续晴天的中午取材，选取洁净、生长旺盛的部位，现取现灭菌。外植体可在室内或无菌条件下对枝条进行液体培养催芽，即用刷子沾少量的洗衣粉或肥皂稀溶液把枝条刷洗干净，进行水培或者液体培养，选择新抽生的嫩枝或者嫩芽作为外植体，可降低污染率。或者在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，可有效减少污染。外植体消毒要彻底，可采用多次灭菌法或多种消毒剂交替浸泡以减少带菌。
（四）污染材料的处理
发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
二、褐 变
（一）褐变现象
褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活后，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡。褐变苗如图4-4所示。
图4-4 褐变苗
（二）原 因
1.植物品种（基因型）
一般木本植物的酚类化合物较草本高，组培时木本植物更易褐化。
2.外植体的生理状态
外植体的老化程度、年龄、大小和取材部位都会影响褐变的发生。外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也越容易发生褐变；大的外植体比小的外植体容易发生褐变；成龄材料一般比幼龄材料褐变严重；切口越大，酚类物质的被氧化面积也越大，褐变程度就会越严重。
3.培养基成分
培养基中无机盐浓度过高、CTK水平过高，外植体在最适宜的脱分化条件下，细胞大量增殖，抑制褐变；液体培养不容易发生褐变；pH高容易发生褐变。
4.培养条件
光照过强、温度过高、培养时间过长均加速褐变的发生。
5.材料转移时间
试管苗长时间不转接容易发生褐变现象。
（三）预防措施
1.选择适宜的外植体
选择幼小的植株，选择幼嫩的部位，选择大小适宜的外植体，选择生长旺盛的外植体。
2.选择合适的培养条件
适度的低温、初始培养阶段在暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化，减少褐变；琼脂量的减少、较低的pH利于减少褐变现象的发生；培养基中适宜的细胞分裂素浓度可以减轻或抑制褐变。
3.加快继代转接的速度
将外植体不断转接到新鲜的培养基上，以防止多酚氧化酶的积累，可减少褐变的产生。
4.加抗氧化剂
在培养基中加入抗氧化剂，如硫代硫酸钠、植酸（PA）、抗坏血酸、过氧化氢、半胱氨酸等。吸收剂有活性炭（AC）和PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。抗氧化剂要分次使用，应注意有些抗氧化剂会对培养物产生毒害作用，要避免长期在含这些抗氧化剂的培养基中培养，如果先期褐变得到了控制，就应该从培养基中除去抗氧化剂。
5.加活性炭
在培养基中加入0.1%～0.5%的活性炭可减少褐变的产生，主要利用活性炭的吸附能力来吸附多酚氧化酶。但活性炭在吸附有害物质的同时也吸附营养物质和激素，因此会影响外植体的生长和发育。
三、玻璃化
（一）玻璃化现象
玻璃化是试管苗的一种生理失调症，在植物材料进行离体培养时，由于含水量高，有些培养物的嫩茎或叶片呈现半透明或水渍状的现象。玻璃化苗（见图4-5）植株矮小、节间短、叶水渍状、半透明、脆、易碎。玻璃化苗中因体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低，叶表无角质层，无功能性气孔器，玻璃化的叶子只有海绵组织没有栅栏组织，表现为光合能力和酶活性降低、组织畸形、器官功能不全、分化能力降低、生根困难、移栽后很难成活。玻璃化苗在植物组培中很普遍，有时多达 50% 以上，严重影响繁殖率，造成人、财、物的极大浪费。
图4-5 玻璃化苗
（二）原 因
1.激素浓度不适宜
细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素的比例失调都会导致玻璃化苗的增加。
2.琼脂和蔗糖浓度过低
琼脂和蔗糖浓度与玻璃化苗的比例呈负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃化苗的比率越低。
3.培养条件
培养基的含水量影响玻璃化苗的形成，培养基中含水量越高，玻璃化越严重，温度低、湿度大容易产生玻璃化。
4.通风条件不好
通风条件不好，也容易发生玻璃化现象。
（三）预防措施
1.增加琼脂浓度
在固体培养时，适当增加琼脂的浓度，并提高琼脂的纯度，都可增加培养基的硬度，从而造成细胞吸水受阻，降低玻璃化。
2.提高蔗糖浓度
提高培养基的蔗糖浓度，可提高渗透压，降低培养基的渗透势，减少培养材料水分的获得。
3.改善培养基
增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe元素的含量，降低N和Cl元素的含量，特别是降低铵态氮的浓度，提高硝态的含量，适当降低细胞分裂素浓度是克服玻璃化的重要措施。
4.改善培养条件
用有透气口的封口膜封瓶口或者用有透气垫的瓶盖封瓶口。增加自然光照、控制光照时间、降低温度、降低湿度都可有效控制玻璃化的产生。
5.加入其他物质
在培养基中添加活性炭、多效唑、间苯三酚、根皮苷、CCC等均可有效地减轻和防止玻璃化。
四、生根难
（一）原 因
组培过程中，常碰到扩繁易、生根难的植物。组培生根，多数是愈伤组织生根，愈伤组织过大、激素配比不合理、温度过高或过低、光照时间长短不合理、分化苗玻璃化，都能影响组培苗生根。
（二）解决措施
对于快繁物种，应多设激素水平梯度，选出最佳分化、生根激素浓度配比；合理控制温度、光照（因为各物种间对光、温、激素种类和浓度要求差别很大，所以不能一概而论。研究者应根据自己的实际情况，采取适当措施）。
五、材料死亡
（一）原 因
1.外植体灭菌过度
一旦材料太小或灭菌时间太长，剂量太大，就会导致材料死亡，所以要严格控制外植体的灭菌时间。
2.污 染
大量污染也会造成材料的死亡。
3.培养基配制出现问题
在激素配制或营养成分配制出现问题时，材料容易死亡，常常发生在无生长点的材料和愈伤组织中。
4.培养环境的恶化
温度过高、透气不好、培养过于密集、久不转移、有害气体的累积等都会造成培养材料的死亡。
（二）预防措施
选用较为温和的灭菌剂，降低药物浓度，减少灭菌时间，或选取较为坚强的外植体（生长季节取芽），注意个人卫生，严格按照规则进行操作，认真配制各种母液及培养基，选用含盐量较低的培养基，也可以试着用1/2或1/4的培养基，并调整各激素的用量和配比，还可以适当添加抗生素、活性炭及必要的有机营养，改善培养环境，及时转移和分瓶，加强组培的过渡管理。
六、组培苗瘦弱或徒长
正常的组培苗应当叶色鲜绿，植株粗壮。如果在增殖阶段出现芽苗瘦弱、徒长或节间过长，这种苗会长大，但要比正常的苗瘦弱。有时即使是正常健壮的小苗，若生根阶段培养基或培养环境得不到保障的话，叶尖也会明显伸长，叶片变细、变薄、黄化等。这些苗在过渡培养时会一一死亡。
（一）原 因
1.细胞分裂素浓度过高
细胞分裂素浓度过高，产生的不定芽过多，这些密集的芽若不及时进行转移与分割，很快会变成瘦弱苗。
2.温度过高
高温有利于苗的生长，若温度过高，则会造成节间生长过快。
3.光照不足
培养过程中，如果光照不足，组培苗会变黄、变细、变瘦，加速生长，使苗在短时间内变得更瘦弱。
4.通气不良
通气不良会增加瓶内湿度，容易导致组培苗的玻璃化和徒长。
（二）解决措施
根据植物特点减少细胞分裂素的使用，加速继代培养的速度，适当减少接种的密度，适当降低温度，提高光照时间，调整培养基硬度，改用透气的封口膜。
七、过渡苗死亡率高
（一）原 因
过渡苗死亡率高是由过渡苗的环境条件不适宜造成的。基质的湿度过大会引起根部的溃烂，温度过高、过低都会使组培苗的生长不适。另外还有光照的影响，在过渡期间要适当用遮阳网遮去大部分光照，之后再逐渐增加光照。但是在过渡培养的后期，要提高光照度，否则会造成定植成活率低。
过渡苗管理不精细也是原因之一。当发现组培苗出现不良状况时要及时找出对策，防止其进一步死亡。
（二）解决措施
有针对性地调整配方，改善组培条件，努力培养质量优良的小苗，及时出瓶，防止出现根部的损伤；改善过渡培养的环境，自动温控，及时灌水，加强过渡苗的肥水管理和病虫害防治。
八、变异和畸形
（一）原 因
变异和畸形是指在培养过程中，由于激素、环境等的作用，使得组培苗的外部形态和内部生理发生变化，引起畸变、矮化、丛生、叶片变厚等现象。变异主要是由于温度过高引起的，环境变得恶劣时也会发生变异；畸变主要是由激素种类和浓度导致的。
（二）解决措施
可根据植物的种类和生长习性，降低细胞分裂素的浓度，调节生长素与细胞分裂素的比例，改善环境等来减轻变异和畸变。
九、其他问题
（一）初期培养阶段
（1）培养物水渍状、变色、坏死、茎断面附近干枯。
原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。
改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。
（2）培养物长期培养几乎无反应。
原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。
改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2，4-D，调整培养温度。
（3）愈伤组织生长过旺、疏松，后期水渍状。
原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。
改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量，增加培养基硬度。
（4）愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢。
原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。
改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。
（5）侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织。
原因：枝条过嫩，生长素、细胞分裂素用量过多。
改进措施：减少激素用量，采用较老化的枝条。
（二）继代增殖培养阶段
（1）苗分化数量少、生长慢、分枝少，个别苗细高。
原因：细胞分裂素用量不够、温度偏高、光照不足。
预防措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度。
（2）苗分化过多，生长慢，部分苗畸形，节间极度缩短，苗密集丛生微型化。
原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。
预防措施：减少细胞分裂素用量或停用一段时间，调整培养温度。
（3）分化出苗较少，苗畸形，培养较久可能再次出现愈伤组织。
原因：生长素用量偏高，温度偏高。
预防措施：减少生长素用量，适当降温。
（4）叶粗厚、变脆。
原因：生长素用量偏高，或细胞分裂素用量偏高。
预防措施：减少激素用量，避免叶片接触培养基。
（5）再生苗的叶缘、叶面等处偶有不定芽分化出来。
原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。
改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段利用这一再生方式。
（6）丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽。
原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。
改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。
（7）幼苗生长无力，发黄落叶，有黄叶、死苗夹于丛生苗中。
原因：瓶内气体状况恶化，pH变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。
改进措施：及时转接，降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。
（8）幼苗淡绿，部分失绿。
原因：无机盐含量不足，pH不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。
改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调整pH，调控温度、光照。
（三）生根培养阶段
（1）培养物久不生根，基部有伤口，没有适宜的愈伤组织生长。
原因：生长素种类不合适、用量不足；生根部位通气不好，pH不合适，无机盐浓度不合适。
预防措施：更换使用的生长素种类和用量，改用滤纸桥法生根。
（2）愈伤组织生长过大，根部肿胀畸形，几条根并联或愈合，苗发黄受抑制或死亡。
原因：生长素种类不合适，用量过大。
预防措施：更换生长素的种类和用量。
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