第二节 显微镜检查
一、概念
应用制片、显微镜放大技术，检查药品中动植物细胞、组织学和矿物晶体光学结构的一种方法。
二、技术依据及原理
药材及成方制剂显微鉴别法就是应用动植物细胞、组织学和矿物晶体光学等知识鉴别中药材或中成药的一种方法。通常是借助显微镜进行观察，故通称“显微鉴别法”。此法适用于：①药材性状鉴别特征不明显或外形相似而组织构造不同。②药材破碎不易辨认或区分。③药材呈粉末状或为成方制剂。④用显微化学方法确定药材中有效成分在组织中的分布状况及其特征。
在进行显微鉴别时，首先要将供试品制成适于镜检的标本。对于完整的药材可制成各种切面的切片；对于粉末药材（包括散剂等中成药）可直接装片或作适当处理后制片。
三、材料、仪器、试剂的准备及基本要求
1.仪器
仪器生物光学显微镜（最好具2.5X或4X物镜头及偏光镜）、显微描绘器、滑走切片机或徒手圆筒生物切片器、镜台测微尺、目镜测微尺、离心机（若条件具备，可以配置显微摄像系统及显微图谱处理系统）。
2.用具
（1）放大镜、刀片、解剖刀、镊子（包括粗镊及眼科弯镊与直镊）、剪（眼科剪与手术剪）、解剖针。
（2）载玻片、盖玻片。
（3）吸湿器（即玻璃干燥器改装纯化水加微量苯酚，潮气润湿药材样品用）、培养皿或小烧杯（放切片用，切片后的处理均可在其中进行）、酒精灯、铁三角架、石棉网、滴瓶、试管、试管架、滴管、玻璃棒（粗与细）、乳钵、量筒。
（4）毛笔（从刀上刷取切片用）、铅笔（HB、4H、6H绘图用）、带盖搪瓷盘（装切片标本用）、纱布、吸水纸（滤纸）、火柴等。
3.试液
（1）水合氯醛试液。取水合氯醛50g，加水15ml与甘油10ml使溶解，即得。此液为透化剂，可使干缩的细胞壁膨胀而透明，并能溶解淀粉粒、树脂、蛋白质及挥发油等。
（2）甘油醋酸试液（斯氏液）。取甘油、冰醋酸与水各等份，混合即得。此液专用于观察淀粉形态，可使淀粉粒不膨胀变形，便于测量其大小。
（3）甘油—乙醇溶液。取甘油1份，50％乙醇1份，混合即得。此液为封藏液，用于保存植物材料及临时切片，有软化组织的作用。
（4）苏丹Ⅲ试液。取苏丹Ⅲ0.01g，加90％乙醇5ml溶解后，加甘油5ml，摇匀即得。本液应置棕色玻璃瓶内保存，在2个月内应用。此液可使木栓化、角质化细胞壁及脂肪油、挥发油、树脂等染成红色或淡红色。
（5）钌红试液。取10％醋酸钠溶液1～2ml，加钌红适量使呈酒红色即得。本液应临用新制。此液可将黏液染成红色。
（6）间苯三酚试液。取间苯三酚1g，加90％乙醇100ml使溶解，滤过即得。应置棕色玻璃瓶内，在暗处保存。此液与浓盐酸合用，可将木化细胞壁染成红色或紫红色。
（7）碘试液。取碘化钾0.5g，溶于少量水中，加碘1g，使溶解，加水至100ml即得。应用时通常再加水稀释成淡棕色或淡黄色。本液应置棕色瓶内保存。此液用于检查淀粉，染成蓝色或紫色；蛋白质或糊粉粒呈黄色。
（8）硝铬酸试液。取硝酸10ml，加入100ml水中，混匀。另取铬酸10g，加水100ml使溶解。用时将二液等量混合。此液为常用的“植物组织解离液”。检品的解离浸泡时间，按材料的质地不同而异。
（9）а-萘酚试液。取15％的а-萘酚乙醇溶液10.5ml，缓缓加入硫酸6.5ml，混匀后再加乙醇40.5ml及水4ml，混匀即得。此液用于检查菊糖，染成紫红色，并很快溶解。
（10）硝酸汞试液（米隆氏试液）。取汞4.5g，加发烟硝酸3ml，俟作用完毕，加等量水稀释即得。本液应置棕色玻璃塞瓶内，在暗处保存。此液用于检查糊粉粒，染成砖红色。
（11）氯化锌碘试液。取碘化钾8g，加水8.5ml使溶解，再加无水氯化锌2.5g使溶解，加碘适量至饱和，即得。本液应置棕色玻璃塞瓶内。此液用于检查木质化与纤维素细胞壁，前者显黄棕色，后者显蓝色或紫色。
四、显微标本片的制作
1.切片制作标本片（横切或纵切）
（1）药材的预处理。先将药材表面泥沙刷洗干净，将应观察的部位切成适当大小的块或段，一般以宽1cm、长3cm为宜，切面削平整。质地软硬适中的药材可直接切片；质地坚硬的则须先使其软化后再切片。软化方法可放在吸湿器中闷润，或在水中浸软或煮软。有些根、根茎、茎及木类药材，质地坚实，可将削平的切面浸水中片刻，表面润湿时取出，直接切片也能切成较完整的薄片。过于柔软的材料，可将其浸入70％～95％乙醇中，约20min后可变硬些，即可进行切片。对于细小、柔软而薄的药材，如种子或叶片，不便直接手持切片。种子类可放在软木塞或橡皮片中（一侧切一窄缝，将种子嵌入其中），叶类药材可用质地松软的通草或向日葵的茎髓作夹持物进行切片。
药材在预处理时应注意不能影响要观察的显微鉴别特征。如要观察菊糖、黏液等，在软化、切片、装片等过程中，均不可与水接触，以免溶解消失；观察挥发油、树脂等，则不可与高浓度乙醇或其他有机溶媒接触。
在检验工作中，徒手切片最常用，操作简便，迅速，制成的切片保持了其细胞内含物的固有形态，便于进行各种显微化学反应观察。
（2）切片。右手持刀片，左手拇指和食指夹持药材，中指托着药材的底部，使药材略高出食、拇二指，肘关节应固定，使材料的切面保持水平，刀口向内并使刀刃自左前方向右后方切削，即可切得薄片。操作时，材料的切面和刀刃须经常加水或50％乙醇保持湿润，防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛笔蘸水轻轻从刀片上推入盛有水或50％乙醇的培养皿中。
（3）徒手圆筒生物切片器切片。将药材用软木夹持，固定于切片器持物筒中；具有一定硬度的材料可直接固定于持物筒中。左手持切片器，拇指与小指持底盘的边缘，食指端顶动中柱上的固定螺帽，可使材料无级上升，每动一格材料上升约10μm，顶动螺帽时，同时将底盘向反方向略转动，使切片器整体方向不变，以保持材料的切片方向固定；右手持切片刀，刀柄靠于拇指与食指根部，食指与中指轻压于刀片的上面，刀片平贴于切片器圆台上，由左上方至右下方迅速滑动，切下的切片用毛笔蘸水取下置盛水的培养皿中。
（4）装片。选取薄而平整的切片置载玻片上，根据所要观察的内容要求，滴加适宜的试液1～2滴，盖好盖玻片，即可在显微镜下观察。如加水合氯醛试液透化，将薄片移载玻片上，滴加1～2滴水合氯醛试液，在酒精灯上微微加热，至边缘起小泡即停止加热，继续补充试液再加热，以不烧干为度直至透化完全为止；加热温度不能过高，以防水合氯醛试液沸腾，使组织内带入气泡；加热时应将载玻片不断移动，不宜对准一处烧，以免受热不匀而炸裂；透化后放冷，加甘油乙醇试液1～2滴后加封盖片，贴上标签。冬日室温较低时，透化后不待放冷即滴加甘油乙醇液，以防水合氯醛结晶析出而妨碍观察。水合氯醛试液有洁净透明作用，并能使已收缩的细胞膨胀，能清楚观察组织构造，可溶解淀粉粒、蛋白质、叶绿体、树脂、挥发油等，对草酸钙结晶无作用，为观察草酸钙结晶的良好试剂。如需观察菊糖等一些多糖物质则加水合氯醛试液不加热。
（5）滑走切片机切片。此法不需要较高的技巧，只要了解掌握操作方法，短时间内即可学会并切出较薄的切片，适用于切质地坚实、形状较大的药材，柔软的材料经冷冻处理亦可切得较薄的切片。
（6）材料制备。经软化处理的材料，检查软化是否合适，可用刀片切割材料，若较容易切下薄片，则表示软化适宜。柔软的材料可直接用胡萝卜或土豆、软木作夹持物。新鲜材料则直接浸入石蜡中，使材料外面包上一层石蜡。
（7）切片机调试及材料安装。切片前，先安置好切片机使稳固，进行调试检查；将切片刀夹持在夹刀器上夹紧，调整刀的角度（0°～15°）；调整厚度调节器到所需厚度。把制备好的材料用两块软木夹住或直接放在切片机的材料固定器上夹紧夹正，使材料露出软木块或固定器上端0.5cm，调整好材料高度，使刀刃靠近材料的切面，使材料切面与刀刃平行并略高于刀刃0.5～1mm。
（8）切片用右手握夹刀器柄。往操作者方向迅速拉动，便切下切片，且附着于刀的表面上，用毛笔蘸水把切片取下放于盛水的培养皿中。将刀推回原处，转动厚度推进器，用毛笔蘸水润湿材料切面及刀刃，再拉切片刀，往返推拉，可得到许多厚度均匀完整的切片。若切片不成功，应检查切片刀是否太钝，则应磨刀或换锋锐的切片刀，若切得太薄而破碎，则逐渐增加厚度能切得完整的薄片为度。注意：夹持在材料固定器上的材料切面接近于固定器上端时，必须注意防止切片刀刃碰撞固定器而损毁切片刀。
（9）装片。为防止切片弯卷，可选取理想的切片，用两张载玻片夹住，浸于水中放置4h使材料压平，放入95％乙醇中固定，甘油装片观察。
2.粉末制片
主要用于粉末状的药材及药材粉末制成的成方制剂观察。
（1）粉末制备。药材要先干燥，磨或锉成细粉，装瓶，贴上标签。粉末制备时，注意取样的代表性，应注意各部位的全面性，例如，根要切取根头、根中段及根尾等部位，必须全部磨成粉，不得丢弃渣头，并需通过4号筛，混合均匀。干燥时，一般温度不能超过60℃，避免经受高温，使淀粉粒糊化，难以观察其完整者。
（2）制片法。用解剖针挑取粉末少许，置载玻片的中央偏右的位置，加适宜的试液1滴，用针搅匀（如为酸或碱时应用细玻璃棒代替针），待液体渗入粉末时，用左手食指与拇指夹持盖玻片的边缘，使其左侧与药液层左侧接触，再用右手持小镊子或解剖针托住盖玻片的右侧，轻轻下放，则液体逐渐扩延充满盖玻片下方。如液体未充满盖玻片，应从空隙相对边缘滴加液体，以防产生气泡；若液体过多，用滤纸片吸去溢出的液体，最后在载玻片的左端贴上检品的标签或书写上标记。
（3）中药成方制剂的鉴别。按剂型不同，分别将样品处理后，按粉末制片法装片观察。
3.散剂
可直接取出粉末装片或透化装片。
4.片剂
可取2～3片研细后，取粉末适量装片或透化装片。
5.含挥发性成分的制剂
取其粉末进行微量升华装片。
五、制片注意事项
粉末加液体搅拌及加盖玻片时容易产生气泡。如用水或甘油装片时，可先加少量乙醇使其润湿，可避免或减少气泡的形成；或反复将盖玻片沿一侧轻抬，亦可使多数气泡逸出。搅拌时产生的气泡可随时用针将其移出。
装片用的液体如易挥发，应装片后立即观察。用水装片也较易蒸发而干涸，通常滴加少许甘油可延长保存时间。
需用水合氯醛试液透化时，应注意掌握操作方法。装片后用手执其一端，保持水平置小火焰上1～2cm处加热，并缓缓左右移动使之微沸，见气泡逸出时离开火焰，待气泡停止逸出再放在小火上，并随时补充蒸发的试液，如此反复操作，直至粉末呈透明状为止，放凉后滴加甘油镜检。
粉末药材制片时，每片取用量宜少不宜多，为使观察全面，可多做些制片。如果取量多，显微特征单一轮廓不清，反而费时，不易得出准确结论。中成药制剂的粉末检查，因在多味药材粉末中寻找某一味药的某一显微特征，有时较难查见，可以多取一些，置试管或小烧杯中，加入水合氯醛试液，加热透化。透化好后，再用吸管吸出，滴在载玻片上，加盖玻片，即可观察。
六、表面标本片
主要用于叶类、花类（萼片、花瓣）、果实、草质茎及鳞茎等药材的表面特征，如毛茸、气孔、表皮细胞等的观察。质地薄的药材可以整体装片，较厚的药材则须撕下表皮然后装片。
七、整体装片
适用于较薄的叶片、萼片和花瓣。剪取欲观察部位约4mm2的两小片，一反一正放在载玻片上，加水合氯醛试液，加热透化至透明为止，盖好玻片即得。
另法：剪取欲观察薄片8mm2，置试管中加水合氯醛试液加热透化，然后移至载玻片上，切成相等两部分，将其中一片翻过来，与另一片并列，再加1～2滴封藏液，盖好玻片即得。
八、表面撕离装片
凡较厚的或新鲜的药材，用上法不能使之透化或不便于整体装片。将软化了的或新鲜材料固定住，然后用镊子夹住要剥取撕离的部分，小心地撕离；或用解剖刀轻轻割（刮）去不需要的各层组织，只保留表皮层（上层或下层），将欲观察的表皮表面朝上，置载玻片上，加透化剂透化后，放冷，加稀甘油1滴，盖上玻片，贴上品名签，即得。
九、解离组织片
适用于厚壁组织或输导组织等的单个细胞的显微观察。将样品切成段（长约5砌，粗约2mm）或片（厚约1mm），对于木类或茎类木质部，最好切成纵长的小段。然后根据细胞壁的性质，按照下列方法之一进行处理：如样品坚硬，木化组织较多或集成较大群束，可用硝铬酸法或氯酸钾法；对于薄壁组织占大部分，木化组织少或分散存在的样品，可用氢氧化钾法。
1.氢氧化钾法
置样品于试管中，加5％氢氧化钾溶液2～5ml加热至用玻璃棒挤压，能离散为止，倾去碱液，加水洗涤后，取出少量置载玻片上，用解剖针撕开，以稀甘油装置观察。
2.硝铬酸法
置样品于小烧杯中，加20％硝酸与20％铬酸的等量混合液适量，使之浸没样品，放置30～60min，坚硬的样品需时要长些，也可在水浴上微温，至用玻璃棒挤压能离散为止，倾去酸液，用水洗涤后，取出少量置载玻片上，用解剖针撕开，以稀甘油装置观察。
3.氯酸钾法
置样品于试管中，加硝酸溶液（1～2ml）及氯酸钾少量，缓缓加热，待产生的气泡渐少时，再及时加入氯酸钾少量以维持气泡稳定地发生，至用玻璃棒挤压能离散为止。倾去酸液，用水洗涤后，撕开，封藏。
4.注意事项
用氯酸钾法制片时，每次加入的氯酸钾不可过多，加热温度不宜过高，否则突沸容易使液体溢出管外。加热时间长短因样品的硬度和木化程度而异，通常需5～15min。操作过程中产生的氯气有毒，应注意通风。
用硝铬酸法解离也可在载玻片上进行。即取一块厚度适当的切片，置载玻片上，滴加硝铬酸试液使之浸没，放置约20min后，轻轻压下或移动盖玻片使之分离，其余操作同前，此法解离的细胞，可以看清其分离的组织部位。
十、花粉粒与孢子制片
取花粉、花药（或小的花）或孢子囊群（干燥样品浸于冰醋酸中软化），用玻璃棒捣碎，纱布过滤，滤液置离心管中，离心，取沉淀加新鲜配制的醋酐与硫酸（9∶1）的混合液1～3ml，置水浴上加热2～3min，离心，取沉淀，用水洗涤2次，加50％甘油与1％苯酚3～4滴，用品红甘油胶封藏观察。也可直接用水合氯醛试液装片，具体操作同粉末标本片。
十一、磨片
凡需观察断面，以一般切片法无法制作的标本，如坚硬的动物类药材、珍珠、石决明、动物骨骼、矿物药等可采用磨片法制片。片的厚度一般为20～50μm。磨片方法有手工磨制与机器磨制两种。
1.手工磨制
选取合适的材料，一般以1～2mm为度，先置粗磨石（或磨砂玻璃板）上，加适量水，用食指、中指夹住材料，在磨石上往返研磨，待两面磨均匀，厚度数百微米后，改用软木塞压在上面，再在细磨石上加水磨，磨至透明时（20～50μm），用水冲洗，再用95％乙醇处理，封藏。
2.机器磨制
按照仪器说明书中的方法进行操作。
十二、显微测量
显微鉴定时应用测量方法测定细胞及细胞内含物等的大小，应用最多的是长度测定。常用的量具是目镜测微尺与载物台测微尺。
1.目镜测微尺
又称目镜量尺或目微尺。它是放在目镜内的一种标尺，是一个直径18～20mm的圆形玻璃片，中央刻有精确等距离的平行线刻度，常为50条或100条。
目镜测微尺是用以直接测量物体的，但其刻度所代表的长度会根据显微镜放大倍数不同而改变，故使用前必须用载物台测微尺来标化。
2.载物台测微尺
又称镜台测微尺或台微尺。它是一种特制的载玻片，中央粘有一小圆形玻片，上刻有将1栅（或2mm）精确等分为100（或200）小格的细线，每一小格长为10μm，它是用以标化目镜测微尺的。
3.目镜测微尺的标化
是用来确定使用同一显微镜及特定倍数的物镜、目镜和镜筒长度时，目镜测微尺上每一格所代表的实际长度。
将载物台测微尺置于显微镜镜台上，按常规对光调焦，并移动测微尺物象于视野中央；从镜筒中取下目镜，旋下接目镜的目镜盖，将目镜测微尺放入目镜筒中部的光栏上（应正面向上），旋上目镜盖后返置镜筒上。此时在视野中，除镜台测微尺的像外，还同时可观察到目镜测微尺的分度小格，移动镜台测微尺和旋转目镜，使两种量尺的刻度平行。左边的“0”刻度重合，寻找第二条重合刻度。记录两刻度的读数，并根据比值计算出目镜测微尺每小格在该物镜条件下所相当的长度（μm）。例如：接目镜头为10×，接物镜头为40×时，目镜测微尺每17小格相当于载物台量尺4小格，则目镜测微尺每1小格的长度为4×10μm÷17＝2.35μm。
4.测定细胞及细胞内含物的方法
将载物台测微尺取下，换以装有待测标本的载片。对光，调焦，移动载片，使需测量的目的物置于目镜量尺范围内，调清物像，计数出目的物占测微尺的小格数，乘以目镜量尺每1小格的长度值即得。
计算公式：
待测物体长度（μm）
例如：测得淀粉粒长径为20小格，每小格长2.35μm，20×2.35μm＝47μm。
5.注意事项
（1）测量通常是在高倍镜下进行的，因目镜量尺的每一小格的长度值较小，结果较为准确。但如测量较长的物体如纤维、非腺毛等的长度时，则在低倍镜下测量较为方便。
（2）每次测量记下数据，并分析数据最小量值、最大量值和多见量值（μm）。如浙贝母淀粉粒直径为6～56μm，表示最小量值和最大量值；如为6～40～56μm，中间的数值表示多见量值。测量直径时，应以物体中部为准。
（3）目镜测微尺所代表的长度值随不同目镜与物镜配合而异，因此在试验前，应将专用的目镜测微尺，在所用显微镜不同倍数的目镜与物镜组合后，测量其长度值，全部测定后记载于试验记录本或将数值表贴在显微镜座上，备用。
（4）测量时，如大小与规定有差异时，允许有少量略高于或低于规定的数值。
十三、显微鉴别法注意事项
粉碎用具用毕后，必须处理干净，干燥后才能使用于另一种药材。
所用盖玻片和载玻片应绝对干净。新片要用洗液浸泡或用肥皂水煮半小时，用水冲洗，再用纯化水冲洗1～2次，置于70％～90％乙醇中，取出，烘干。
进行显微鉴别试验时有一定的步骤，一般先进行甘油醋酸片的观察，后进行水合氯醛片观察，最后再进行滴加试剂或结合其他理化试剂的显微观察。所以在试验中，首先观察有无淀粉粒，若有，不论其多少和大小，首先描述，其次方是其他的显微特征。
为提高显微鉴别的正确性，可与对照药材或已经鉴定品种的药材对照观察。
成方制剂鉴别前，应了解处方组成，分析处方中各种药材的主要鉴别特征及其量的多少，进行显微观察时，至少观察5片以上，使特征不致遗漏。
十四、记录
组织特征的记录，应按从外至内的次序进行，对有鉴别意义的特征需详细地描述，并要绘制简图。有条件的可进行显微照相及制作显微图谱。
粉末显微鉴别时，先记录原粉末的色泽、气味。然后边观察、边记录。注意观察的全面性。观察每张粉末片时，应自上左至下右，呈“之”字形扫描，逐渐移动粉末片，全面观察应找的特征，将每个特征一一描述及绘图，在观察与描绘时，即应测定其长度，一一做记录，分析统计其长度（最小量值、多见量值、最大量值）。
描述特征时，应根据先多数后少数的顺序，将易见、多见的特征先加以描述，顺次而为少见的，最后方描述偶见的，并在特征项下加注“多见”“少见”等字样。描述应先着重描述特殊的组织、细胞和含有物。对于各类药材均具有的一些基本组织，如叶类药材有栅栏细胞、海绵细胞、细小导管等可不作重点描述。
绘图时应注意特征明确、线条清晰。绘图方法有徒手或采用显微描绘器、显微图像处理系统等方法。徒手绘图时，一边用左眼向显微镜内观察，一边睁开右眼将视野中特征图像用铅笔（HB画粗线、4H画中线、6H画细线）转绘于记录纸上。如采用显微描绘器绘图或显微摄影、显微图像处理系统绘图，可根据各仪器的操作要求进行，并要注明放大倍数，或加比例尺。
十五、结果判定
根据检验的显微特征记录与标准记载或对照药材比较是否相符，断定其真伪或是否有掺伪。
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