第七节芯片技术（

第七节　DNA芯片技术（DNA chips）

DNA传统的测序方法是Maxam和Gilbert的化学法以及Sanger的末端链终止法，但随着分子生物学的发展，近年来一种全新的DNA测序方法，杂交测序以及基于杂交测序发展起来的DNA芯片或叫基因芯片的技术应运而生。DNA芯片能在一次实验中同时自动、快速、敏感地检测数千条序列，而且获得信息高度特异、稳定，被誉为遗传信息方面革命性的里程碑。它可用于基因多态性分析、突变的检测、病原的检测等，DNA芯片技术是当今世界基因序列分析、基因检测的万能钥匙，该技术的发展必将极大地加速诊断技术的发展，使得诊断技术简单化、自动化与现代化。

一、DNA芯片的基本原理

DNA芯片的基础是杂交测序，后者基本原理是：任何线状的DNA或RNA序列均可被测序；反过来，假如我们把原序列中的所有这些错落重叠的8体亚序列全部检测出来，就可以据此重新组建出原序列。对于一个未知DNA序列，可以用人工合成的、已知序列的所有可能的N体寡核苷酸探针与之杂交（在8体寡核苷酸，G、C、T、A四者自由组合而成所有可能的序列共有4⁸＝65536中）。通过对杂交的检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而获知靶DNA中的所有8体亚序列，组合分析后者（有电脑软件进行）即可重构靶DNA中的序列，此即SBH。前人的实验充分证明了SBH测序的能力。SBH可分成两种类型：Ⅰ型，即靶DNA被固定，而被荧光素标记的寡核苷酸探针一个一个与之杂交，最后检出所有能与靶DNA杂交的ODT探针；Ⅱ型，即靶DNA被标记而ODT探针被固定。根据Ⅱ型SBH，采用特殊工艺在一块小的基板上定位合成所有可能的N体ODT探针而形成一个高密、微化的寡核苷酸阵列（ODTA），这就是DNA芯片。对于阵列上的任一ODT，它的序列都是已知的，且呈一对一的关系。当加入经PCR扩增的、限制性内切酶处理和荧光素标记的一小滴单链靶DNA后，它将以碱基互补配对原则，与芯片上的所有互补的ODT探针杂交，所有这些杂交构成了一个“杂交模式”，即芯片上的所有杂交信号所在位点的综合，它间接反映靶DNA的所有亚序列，计算机通过对这个“杂交模式”的分析而重建DNA序列。由于杂交反应是平行进行的。故可在同一芯片上一次同时分析多条不同靶DNA序列。

二、DNA芯片的制作

DNA芯片技术的关键在于高密、微化的寡核苷酸阵列（ODTA）的制作，PEASE等人于1994年创造的，光导ODTA化学合成法，为DNA芯片技术奠定了基础。

该合成法有三项基本技术：固相化学，可感光保护基团和照相平版印刷术，后者是该合成系统的基础。

合成反应步骤如下：连接有可感光保护基团X的羟基，通过连接者覆盖于固相基板表面（如玻璃基板），X是可感光保护基团，如NVOC，X与羟基连接时，则羟基不能与加入的脱氧核苷酸发生聚合作用，但光可移去X（即光去保护），去掉X的羟基成为有功能的自由羟基，而可与脱氧核苷酸聚合。

加入的反应物是3’pHosphoramidites激活的、5’端可感光保护的N－乙酰－脱氧核苷对反应起激活作用。合成时，光通过光遮板的一定大小的小孔照射到基板表面的目标合成部位，光的部位发生光去保护，X被移去，自由羟基暴露，此时加入第一批反应物，如含T的反应物，即能与光部位的自由羟基发生化合反应，第一个反应物被嫁接到目标位置上。然后，光通过第二个遮光板，在新的位置嫁接新的反应物。由于加入的反应物也是含X的，故再次被光时，X又被移去，已嫁接上的脱氧核苷酸的自由羟基暴露，可与新加入的反应物化合，从而使寡核苷酸链延长。这样随着反应重复，合成不断进行，最后当所需ODT均合成完毕后，对反应基板进行无遮板的汞光普照，去除所有X，即得到需要的ODTA，这里，光照模式（illumination pattern）和反应物的加入序列决定了合成产物的序列以及在基板上的位置，采用组合合成策略（combinatorial synthesis strategies）使得少的化学步骤能合成最大数量的复合物，如要合成T、C、G、A四个成分所有序列组合的四聚体，可采用下列策略。

整个反应需四个回合，每回合四轮。第一回合自左向右4均分基板，以AGCT的顺序嫁接核苷酸，第二回合同样以AGCT的顺序，自下而上在前面合成的基础上再接上一核苷酸，这样基板上就形成了16个单元，3、4回合即在这每个单元上继续以上述模式嫁接核苷酸。合成结束时，44种四聚体在4⁴次化合反应全部合成，而且每一四聚体的序列、位置均明确知道。用该策略合成一块含所有65536个ODT的芯片只需8h。

由上可知，基板上光点越细、越密集，合成的ODTA密度越高光点大小直接取决于遮板透光孔径的大小，而后者因为衍射而最终受限于所用光的波长。1994年PEASE的技术合成65536个ODT探针的芯片只需0.64cm²，而近年常用的“半导体光阻”技术可使ODTA密度达到10⁶～10⁷ cm²。

三、芯片杂交的检测方法

靶DNA－ODT探针杂交的检测方法很多，而采用最广泛的是荧光显影法。简要过程是：靶DNA先被荧光素标记，待与芯片充分杂交后冲洗，用连有“电荷偶连装置照相机”的荧光显微镜分析杂交的荧光信号模式，后者经计算机分析后重建靶DNA序列。激光共聚焦荧光检测是近年广为应用的芯片杂交检测手段，简述如下。

待检品储器中加满荧光素标记的靶DNA溶液，芯片倒置其上，激光从芯片背面射入，聚焦于芯片与靶DNA溶液的相互作用面，这样能与芯片杂交的DNA上的荧光素被激发发光，后者经棱镜后刚好聚焦于空间共聚焦小孔，故能有效通过该小孔而被探测器检测。而焦点外溶液中的荧光信号因不能聚焦于共聚焦小孔，而不能有效通过，故检测不到，这使得冲洗这一步被省去，在数分钟内即可得到一个二维杂交信号模式。并且通过改变系统温度还可获得杂交的热动力学数据。

计算机软件的改造使序列阅读更加直观。另外，若把电子微芯片与CCD结合，作成微芯片CCD，直接放于DNA芯片的下面记录杂交模式，即可使荧光显微镜都不再需要。

四、芯片技术的问题及其进展

DNA芯片技术存在的问题大致可概括为以下3点，随着这些问题的解决，芯片技术本身也不断发展。①靶DNA与ODT探针的杂交存在着错配、未配的情况；②靶DNA自身二级甚至三级结构的形成；③靶DNA存在串联的重复序列会使计算机重构序列时产生分支点而无法排序。这些问题已逐步解决。DNAA的出现使DNA芯片由ODTA扩展到ODTA＋DNAA。而“生物芯片”则是一个包含DNA芯片的范畴更广的概念。