基因芯片的主要技术流程

基因芯片主要技术流程包括芯片的设计与制备、靶基因的标记、芯片杂交与杂交信号检测。

（一）基因芯片的设计

基因芯片的设计实际上是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的。目前，应用范围主要包括基因表达、转录图谱分析以及靶序列中单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）或突变点的检测。表达型芯片的目的是在杂交实验中，对多个不同状态样品（不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激）中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的基因，可设计多个序列不相重复的探针，使最终的数据更为可靠。

基因单碱基多态检测的芯片，一般采用等长移位设计法，即按靶序列，从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列，形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其他3种碱基替换，形成3种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的SNPs位点进行扫描。

（二）芯片的制备方法

芯片制备方法主要有两种。

1．点样法　首先是探针库的制备，根据基因芯片的分析目标，从相关的基因数据库中选取特异的序列，进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后通过计算机控制的三维坐标工作平台，用特殊的针头和微喷头，分别把不同的探针溶液逐点分配在固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学的方法使之固定，该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的基因芯片。

2．原位合成法　该法是在玻璃等硬质材料表面，直接合成寡核苷酸探针阵列，其关键技术是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。

（三）待分析样品的制备

待分析样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节，靶基因在与芯片探针结合杂交之前，必须进行分离、扩增及标记。根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同，标记方法也有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、反转录或体外转录过程中，实现对靶基因的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片，一般需要从细胞和组织中提取RNA，进行反转录，并加入耦联有标记物的脱氧三磷酸核苷酸（dNTP），从而完成对靶基因的标记过程。对于阵列密度较小的芯片，可以用放射性核素标记，所需仪器均为实验室常规使用设备，易于开展相关工作。

高密度芯片的分析一般采用荧光素标记靶基因，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化，可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。近年来，运用多色荧光标记技术，可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图，获得不同样品间差异表达基因的图谱。对多态性和突变检测型基因芯片，采用多色荧光技术，可以大大提高芯片的准确性和检测范围。例如，用不同的荧光素分别标记靶序列及单碱基失配的参考序列，使它们同时与芯片杂交，通过不同荧光强弱的比较，得出靶序列中碱基失配的信息。

（四）分子杂交

待测样品经扩增、标记处理后，即可与DNA芯片上的探针阵列进行分子杂交。DNA芯片将大量探针集成在芯片上，这种方式不仅使得检测过程平行化，一次可对大量样品信息进行检测分析，而且由于集成的显微化，使得杂交所需要的探针及待测样品均大为减少，杂交时间明显缩短，分子杂交过程一般可在30min内完成。

（五）检测分析

待测样品与芯片探针阵列杂交后，荧光标记的样品结合在芯片的特定位置上，未杂交的分子被除去。然后在激光的激发下，含荧光标记的DNA片段发射荧光。样品与探针严格配对的杂交分子的热力学稳定性高，所产生的荧光强度最强；不完全杂交（含单个或两个错配碱基）双链分子的热力学稳定性低，荧光信号弱；不能杂交则检测不到荧光信号。荧光强度与样品中靶分子的含量有一定的线性关系。应用激光扫描仪或激光聚焦显微镜，可以采集各杂交点的荧光信号，如荧光位置、荧光强度，再用相关软件进行图像分析和数据处理，并与探针阵列的位点进行比较，即可得出待测样品的信息。