奶牛衣原体性流产和布氏杆菌病原分离及血清学调查

·　宁夏奶牛场中普遍发生一种以孕牛流产、早产、死产或产无活力弱犊的繁殖障碍性格疾病，给奶牛场带来严重的经济损失。本项研究通过病原分离培养及血清学调查，分离出两株（CYP1、CYP2）微生物，经染色镜检、琼脂免疫扩散试验、药敏试验与碘染色试验，确定为鹦鹉热衣原体。通过对奶牛衣原体血清学抗体调查，在4个牛场的384份血清，牛场阳性率为100％，牛群平均阳性率28.4％。4个牛场牛群阳性率分别为11.8％、38.5％、20％、36.3％。对不同年龄检测1.5岁以下阳性率为7％，1.5～3岁阳性率为29.5％，3岁以上阳性率为34.4％，而布氏杆菌病血清血检测全部都是阴性。

宁夏畜牧兽医研究所

奶牛衣原体性流产和布氏杆菌病原分离及血清学调查

何存利　张皓弘　张国玲

多年以来，宁夏奶牛场中普遍发生一种以孕牛流产、早产、死产或产无活力弱犊的繁殖障碍性格疾病。自2003年以来，随着宁夏各市（县）奶牛养殖业的发展，优良品种的引进，奶牛养殖数量的急剧增加，这种疾病的发生越来越严重，主要表现为各个孕期及胎次的母牛都可发病，一般生头胎的母牛或在妊娠7～9月龄（怀孕的中后期）常发病。发病前，母牛无任何特殊征兆，产出死胎或无活力的犊牛，胎衣排出迟缓，有的发生子宫内膜炎、乳房炎，随后产奶量较低。更为严重者，阴道排出脓性恶臭的分泌物，出现全身性脓毒败血症甚至死亡，该病的发生给奶牛场带来严重的经济损失。为了诊断此病，进行了病原分离及血清学调查工作。

一、材料与方法

（一）病料

来源于银川市某奶牛场，收集流产的胎儿，剖检，无菌采集胃液及其肝、脾、肾，将病料涂片、染色、镜检，挑选含有疑似衣原体或包涵体病料供分离用。

鹦鹉热衣原体体阴性、阳性血清，鹦鹉热衣原体正向间接血凝抗原由中国农科院兰州兽医研究所购入。7日龄鸡胚由本室孵育。

（二）分离培养

布氏杆菌分离。将病料直接涂抹于含5％血清、0.5％葡萄糖肝汤琼脂

平皿上，放入含5％CO₂培养箱37℃培养5天。每份病料接种3个平皿。

衣原体分离。将病料用含有链霉素、卡那霉素的磷酸盐缓冲液制成15％悬液，4000 rpm离心30分钟，取上清液在室温放置3小时，将上清液接种7日龄鸡胚。接种时，在蛋的气室端，以5％碘酊消毒外壳，钻孔，将注射针头垂直刺入3.0～3.5 cm，接种剂量每鸡胚0.2 ml。每份病料接种5枚胚，然后重新用碘酊涂擦针孔局部，以熔化石蜡封口。接种后鸡胚置38℃孵育，收集4～7天死亡鸡胚传代。如果鸡胚不死亡，盲传3代。

（三）分离菌染色镜检

经过多次传代后，鸡胚死亡时间稳定在4～7天，收集其卵黄膜，涂片、染色、镜检并作细菌常规培养。染色方法采用马契维诺氏法，步骤为涂片自然干燥后，以甲醇固定，干后滴加碱性复红溶液染5分钟，水洗，在柠檬酸溶液中脱色3秒，至呈粉红色为宜，用自来水冲洗后，再以美蓝复染15秒，水洗，干后镜检。

（四）分离株CYP1、CYP2病原鉴定

鹦鹉热衣原体参考株C及分离株CYP1、CYP2的培养、浓缩及纯化。将鹦鹉热衣原体参考株C接种7日龄鸡胚卵黄囊内，鸡胚置38℃温箱孵育，收集4～7天死亡的鸡胚。在无菌条件下吸取卵黄膜，镜检无杂菌，并有多量原生小体，将此卵黄膜合并研磨，用生理盐水制成1∶10倍乳剂。2000 rpm离心10分钟，弃去离心管底的残渣和上层的卵黄，取中间层的悬液8000 rpm离心20分钟，弃上清将沉淀悬浮于生理盐水中，充分吹打，使沉淀均匀分散后，用300 rpm低速离心5分钟，以除去大颗粒杂质。上清液再8000 rpm离心20分钟，倒去上清液再次将沉淀悬浮于生理盐水中，300 rpm低速离心3分钟，最后取上清液以8000 rpm离心20分钟，将此沉淀悬浮于适量生理盐水中，沿管壁徐徐加入下层装有30％泛影葡胺的离心管。4℃下25000 rpm离心120分钟，收集中层乳白色带洗去泛影葡胺，样品做琼脂扩散试验。CYP1、CYP2的培养、浓缩及纯化与上述方法相同。

琼脂免疫扩散试验。将分离株CYP1、CYP2培养、浓缩及纯化与鹦鹉热衣原体标准阴性、阳性血清做琼脂免疫扩散试验，方法用杨宜生等著《衣原体和动物衣原体病》介绍的方法进行。

用药敏试验与碘染色试验来区别鹦鹉热衣原体与沙眼衣原体。一是药敏试验。将定量分离株CYP1、CYP2卵黄膜悬液与定量磺胺嘧啶钠混匀，接种7日龄敏感鸡胚，将定量分离株CYP1、CYP2卵黄膜悬液与定量青霉素混匀，接种7日龄敏感鸡胚，同时两组设药物接种对照。二是碘染色试验。用Lugol碘液染色衣原体材料涂片，显微镜观察。

（五）血清学抗体调查

被检血清采自银川、吴忠两市四家规模化奶牛场，共计380份血清。

衣原体血清学调查采用间接血凝试验（IHA），试验试剂、阴阳性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所购入。具体操作按试剂说明进行。判定标准：以50％的红细胞发生凝集的被检血清最高稀释倍数为IHA价，IHA价大于或等16为阳性。

布氏杆菌病血清血调查采用虎红平板凝集试验初检，后采用试管凝集试验，试剂盒由黑龙江省生物制品厂购入，具体操作按试剂说明进行。

二、结果

（一）衣原体分离

先后共进行了2次7份病料接种，有2份病料在第3代以后，可使鸡胚死亡时间稳定在4～7天。吸取卵黄膜作细菌常规培养结果无杂菌。

（二）布氏杆菌分离

先后共进行了2次7份病料接种，没有分离到布氏杆菌。

（三）分离株CYP1、CYP2染色镜检

马契维诺氏法染色，15×100倍镜下观察，可看到在蓝色背景上有多量的圆形红色颗粒。

（四）琼脂免疫扩散试验结果

被检抗原（分离株CYP1、CYP2）孔与阳性血清孔之间出现清晰的沉淀线，并与对照阳性抗原、抗体孔之间的沉淀线末端相互连接。说明分离的2株微生物是衣原体。

（五）药敏试验与碘染色试验结果

将定量分离株CYP1、CYP2卵黄膜悬液与定量磺胺嘧啶钠及青霉素混匀，接种7日龄敏感鸡胚，4～7日后，接种磺胺嘧啶钠的鸡胚死亡，而接种青霉素继续存活。这说明分离株CYP1、CYP2对磺胺嘧啶钠不敏感，对青霉素敏感。Lugol碘液染色CYP1、CYP2材料涂片，结果不着色。说明分离的2株衣原体是鹦鹉热衣原体。

（六）奶牛衣原体血清学抗体调查结果

不同牛场检测结果：在4个牛场的384份血清，牛场阳性率为100％，牛群平均阳性率28.4％，4个牛场牛群阳性率分别为11.8％、38.5％、20％、36.3％。

不同年龄检测结果：1.5岁以下阳性率为7％，1.5～3岁阳性率为29.5％，3岁以上阳性率为34.4％。

（七）布氏杆菌病血清血检测结果

在检测384份血样中，全部都是阴性。

三、小结与讨论

根据临床症状、病原分离培养和血清学检测结果表明，在宁夏某些牛场出现牛流产症，与衣原体感染有关，牛群平均阳性率达28.4％，说明衣原体在宁夏一些地区普遍存在，日趋污染严重，而且表现为随着年龄增大阳性率逐步增高特点。

从发病牛场采集流产的胎儿后分离出2株微生物,该2株微生物在鸡胚传代，可使鸡胚死亡时间稳定在4～7天。对2株微生物进行培养、浓缩、纯化后，作为被检抗原，采用琼脂免疫扩散试验，与衣原体阳性血清能发生特异性反应，与标准抗原琼脂免疫扩散试验结果无明显差异，结合镜检、药敏试验与碘染色试验结果，说明分离的2株衣原体是鹦鹉热衣原体。

奶牛衣原体性流产在我区被发现由来已久，1995年王守智等人在宁夏某奶牛场分离到鹦鹉热衣原体，并对其培养方法、致病性、敏感药物治疗、疫苗免疫等方面进行了广泛研究，并以微量间接血凝试验，抽检宁夏6个县（市）602份血样，进行衣原体血清抗体检测，其阳性率为15.33％～39.39％。调查还表明，规模化奶牛场与衣原体有关的流产率平均为9.155％。本次试验，抽检宁夏4个规模化羊场384份牛血清，牛场阳性率100％，牛群平均阳性率28.4％，最高达38.5％。与十多年检测出的结果基本一致，说明奶牛衣原体在宁夏一些地区仍然普遍存在。由于规模化牛场为了追求较高的经济效益，都从国内外引进优良品种，在抗病能力上与本地牛相比，明显较弱。在调查中，牛场技术人员普遍认为乳房炎和牛流产是导致经济损失重要原因，是目前规模化牛场危害最严重的疾病。因此，加强对奶牛衣原体性流产预防仍然是当前规模化奶牛场疫病防治当务之急。

布氏杆菌是一种侵害多种动物的病原菌，在家畜中以牛、羊、猪最常发生。作者近年来曾多次对流产羊只和流产牛进行布氏杆菌病病原分离工作，但都没有分离到该菌，2004年、2005年抽检宁夏1098只羊血清进行布氏杆菌病血清学抗体检测，没有检出阳性羊，这说明宁夏对布氏杆菌病防治工作卓有成效，但这并不意味着布氏杆菌已被消灭，仍应加强布氏杆菌病的监测工作。