任务4.4 紫外线灭菌技术
4.4.1 实训目的
了解紫外线灭菌的原理和应用范围；掌握紫外线灭菌的操作技术。
4.4.2 实训材料、仪器
1）实训材料
牛肉膏蛋白胨培养基平板，3%～5%石炭酸，2%～3%来苏尔溶液。
2）仪器
4.4.3 实训步骤
1）单用紫外线照射
①在无菌室内或超净工作台内打开紫外灯开关，照射30min，将开关关闭。
②在经紫外线灭菌后的无菌室内或超净工作台台面上，将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。将平板置于37℃恒温培养箱内培养24h，共做三次重复。
③检查每个平板上的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。
2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用
①在无菌室内，先喷洒3%～5%石炭酸溶液，再用紫外灯照射15min。
②无菌室内的台面、凳子用2%～3%来苏尔溶液擦拭，再打开紫外灯照射15min。
③将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。将平板置于37℃恒温培养箱内培养24h，共做三次重复。
④检查每个平板上的菌落数。
4.4.4 注意事项
①因紫外线对人的眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外灯或在紫外灯下工作。
②由于紫外线灭菌具有光复活现象，因此，采用紫外线灭菌时，应保持黑暗。
4.4.5 实训结论
记录紫外线灭菌效果于表4.8中。
表4.8 紫外线灭菌效果记录表
（引自沈萍，微生物学实验，2007）
知识链接
无菌环境与技术
无菌是指不含任何活的微生物。在食品微生物检验时，操作人员必须有严格的无菌观念，许多项目要求在无菌条件下进行，其主要原因：一是防止检验操作中人为污染样品，二是保证检验人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。而要达到无菌的要求，在实验室中主要借助符合规范的无菌室和严格的无菌操作来实现，必要时还需设置生物安全柜。
1）无菌室
无菌室是微生物检测的重要场所与最基本的设施。它是微生物检测质量保证的重要物质基础。无菌室的使用管理要做好以下工作：
（1）无菌室规范要求
无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。面积一般不超过10m2，不小于5m2，高度不超过2.4m。由1～2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间和缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制在18～26℃，相对湿度45%～65%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2～2.5w/m3），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40uw/m2。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。
（2）无菌室的使用要求
无菌室的使用要求如下：
①无菌室使用前后应将门窗关紧，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，照射时间30 min，使用紫外灯时，应注意不得直接在紫外线下操作。紫外灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面的灰尘，以减少对紫外线穿透力的影响。
②处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入。如需传递物品，可通过小窗传递。
③根据无菌室的净化情况和空气中含有的杂菌种类，可采用不同的化学消毒剂。如霉菌较多时，先用5%石炭酸全面喷洒室内，再用甲醛氧化熏蒸；如果细菌较多，可采用甲醛与乳酸交替熏蒸。一般情况下，也可酌情间隔一定时间用2mL/m3甲醛或2mL/m3丙二醇交替熏蒸。
④无菌室必须严格进行无菌程度的检查。测定无菌室无菌程度一般采用平板法，具体操作是将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒入灭菌培养皿内，每皿约15mL培养基，打开皿盖暴露于无菌室内不同的地方，10min后，盖好皿盖。将培养皿倒置于37℃培养24h后，观察菌落情况，统计菌落数。如果每个皿内菌落数不超过4个，则可认为无菌程度好；否则，应对无菌室进一步灭菌，再重复检测。
2）无菌操作要求
无菌操作有以下要求：
①操作人员的个人卫生直接影响无菌操作效果。进入无菌室时，操作人员首先进入缓冲间换上专用的工作服、拖鞋和帽子，再用自来水和肥皂仔细清洗双手，方可进入工作间。进行接种操作前，用75%乙醇对手进行消毒。
②接种所用的吸管、培养皿及培养基等必须经过灭菌处理，打开包装后未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应进行干热灭菌后使用。
③从包装内取出吸管时，吸管尖部不能接触外露部位；使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖部不得触及试管或平皿边。
④接种样品、转接细菌必须在无菌区内操作，接种细菌或样品时，试管口需经火焰灭菌。
⑤接种环和接种针在接种细菌前应经火焰灼烧全部金属丝及能够伸入试管内的部分；接种烈性致病菌的接种工具应在沸水内煮沸5min，再经火焰灼烧灭菌。
⑥吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，或用移液枪（枪头需经过灭菌），不得直接用吸管口吸。
3）有毒、有菌污物的处理要求
微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。另外，还应严格按规定处理有毒、有菌污物。
①经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。
②经微生物污染的培养物，必须经121℃、30min高压灭菌。
③染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃、30min高压灭菌。
④涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道；烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道；染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤；做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。
⑤打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。
⑥污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
