液体培养基大肠杆菌菌落图片

1　材料和方法

1.1　实验菌株及材料

变异链球菌ATCC25175、远缘链球菌ATCC33478、血链球菌ATCC10556（四川大学华西口腔疾病研究国家重点实验室提供）；胰蛋白胨酵母液、固体培养基（TPY培养基）；PBS缓冲液（四川大学华西口腔医学院微生物实验室提供）；戊二醛（分析纯，成都科龙化工试剂厂）；³H-TdR：放射浓度1mCi/ml，（中国科学院上海原子核研究所）。

1.2　实验方法

1.2.1　纳米羟基磷灰石粉末的制备

本实验采用化学沉淀法制备纳米羟基磷灰石粉体。控制Ca²⁺浓度为0.3mol/L将Ca（NO³）²·4H²0溶液放入400r/min磁力搅拌器充分搅拌，缓慢滴加20％氨水，调节Ca（NO³）²·4H²0溶液pH≈9。滴加0.18mol/L的（NH⁴）²HPO⁴溶液，得到白色的沉淀物，保持溶液pH值稳定，滴加完毕后继续搅拌2h。待其反应完毕后，陈化处理，出现沉淀后加入去离子水稀释洗涤，离心，40℃干燥箱中干燥。

1.2.2　实验步骤

菌液制备：将保存在牛奶中的变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌的各株菌种用无菌玻璃棒均匀涂布于TPY固体培养基表面，80％N²、20％CO²，37℃下厌氧培养48h。再将复苏后的各株细菌分别接种于TPY液体培养基中，相同条件下培养18h，涂片观察为纯培养。使用Crystal Spec^TM比浊仪测量菌悬液浓度，用磷酸缓冲液（PBS）配制成浓度为1×10⁸CFU/ml的菌悬液备用。

1.2.3　实验分组

阳性对照组：消毒液体TPY培养基4.9mL接种菌液0.1mL，每组4个平行。阴性对照组：不含细菌的消毒TPY培养基5mL，每组4个平行。实验组：20wt％纳米羟基磷灰石粉末50μL加入4.9mLTPY培养基（浓度2wt‰）加菌液50μL，每组4个平行。将以上3组十二孔板放置于80％N²、20％CO²，37℃下厌氧培养24h后，将12孔板放置于MM-1微型振荡器上，振荡30秒后，菌液待用。

1.2.4　菌液检测

1.2.4.1　螺旋接种仪接种后计数仪计数

将菌液反复用加量枪混合均匀后，用螺旋点板记数仪点板，将平板放置于80％N²、20％CO²，37℃下厌氧培养24h后，进行计数细菌菌落数。

1.2.4.2　3H-TdR闪烁计数

吸取2ml菌悬液于离心管内，2000RPM离心5min，弃上层清液，加入细菌裂解液，4℃冷冻放置24h。吸取80µL细菌裂解液至闪烁瓶中，加闪烁液5mL，无水乙醇3mL，避光放置2h后，用液体闪烁计数仪测定放射性计数cpm。

1.2.4.3　扫描电镜定性观察

吸取细菌悬液，滴入玻璃板上微火烤干玻璃板，放入2.5％戊二醛溶液中固定2h，再次用PBS缓冲液清洗。接着依次放入30％，50％，70％，90％，100％的乙醇溶液中进行梯度脱水，每个梯度脱水15min。再放入100％乙醇异戊酯溶液中做置换处理25min后在CO²临界点干燥机中进行临界点干燥，喷金后在扫描电镜下观察。