肉羊基因第一外显子多态性及其与肉质性状的相关分析

肌内脂肪是影响肉质性状的重要原因，而肌肉内苹果酸酶的活性对肌内脂肪的沉积有一定的影响。苹果酸酶（Malic enzyme 1， ME1）是一种以双二聚体形式存在的四聚体蛋白，是过氧化物酶体增生物激活受体靶基因之一，由14个外显子和13个内含子组成，基因长度106kb以上，广泛存在于自然界中，包括细菌、古菌、真菌、动物和植物，是组成三羧酸循环的一部分。它能够提供脂肪酸合成中所需的NADPH和丙酮酸，其中，NADPH是合成长链脂肪酸所需能量的来源。丙酮酸在LDH 酶催化下可生成乳酸，肌肉中乳酸的含量可影响糖酵解并进而影响肌肉p H值。因此，ME活性的改变，可以影响动物脂肪沉积和肌肉的p H值，从而对肉质性状的形成也产生一定的影响。

Morioka等（1989）鉴定了小鼠的ME1基因，研究结果显示ME1基因是相当大的，至少有95kb。含有14个外显子，大小在76–1513bp之间。外显子的大小和边界是通过Southern杂交和DNA测序而完成的。内含子的5′和3′末端序列与哺乳动物的共有序列是一致的（GT-AG）。S1核酸酶和引物延伸实验显示ME1基因的转录是多起始位点的，最强的一个起始位点在相对于“ATG”－31处。“TATA”和“CCAAT”盒在近启动子区没有出现。对ME1 3′末端分析显示在外显子14处的可选择Poly A信号的利用形成两种类型的m RNAs，分别带有345和1345bp大小的3′UTR。在体内，饲养刺激和饥饿可抑制ME1基因的转录。在鸡胚胎肝细胞培养中，三碘甲腺原氨酸（T3）和高血糖素抑制ME1基因的转录，为了研究这些激素的调控机制，克隆了鸡的ME1基因，ME1基因的编码区由14个外显子和13个内含子组成，基因长度超过106kb。这个基因的大小、外显子的长度和数目及内含子在编码区中的位置鸡与鼠是一致的（Hodnett et al.，1996）。Sourdioux等（1999）研究指出，火鸡ME1基因的多态性与脂肪含量存在相关性。

与人和啮齿类等单胃动物恰好相反，反刍动物脂肪形成主要发生在脂肪组织中，与肝组织相比，大多数脂肪生成酶的活性在脂肪组织中是较高的。在饥饿一段时间后重新给食之后能够诱导酶的活性。Georgios等（2008）克隆了绵羊的两个在3′ UTR长度不同的两个转录本，这也是首次克隆了反刍动物的ME1基因的c DNA序列，并且此序列与其他物种具有较高的同源性，同时研究了ME1基因的m RNA在绵羊各组织中的表达水平，结果表明m RNA在脂肪组织中的表达水平高于肝组织的表达水平。在能量限制（Caloric restriction）两周后重新饲喂，ME1基因的m RNA表达水平在脂肪组织中增加两倍。

在梅山猪和正在育肥的大白猪中，比较葡糖-6-磷酸脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶和ME1脂肪合成酶的活性，比较结果显示ME1活性在梅山猪中是较高的，这可能是影响肌内脂肪沉积的一个主要因素（Mourot and Kouba， 1999）。猪的ME1基因定位到 1号染色体的末端。以前已经报道在这个染色体上有一个影响脂肪沉积的QTL。Vidal 等（2006）分别扩增了ME1基因完整的编码区和3′ UTR 的1457bp和1459bp大小的片段。通过测序，在三个猪品种群体（Landrace、Large White 和 Piétrain）中的3′UTR检测到5个SNPs：C1706T，G1762T，A1807C，C1857A和T1880A。在大白群体的两年世代中检测到三个单倍型：H1（C1706 G1762 A1807 C1857 A1880）， H2（C1706 G1762 A1807 C1857 T1880）和H3（T1706 T1762 C1807 A1857 T1880）。关联分析发现在大白猪群体中，171天的背膘厚和肌肉p H值有显著的相关性。李建华等（2008）采用PCR-SSCP技术分析了猪ME1基因3'UTR在杜洛克、长白猪、皮特兰、金华猪和野猪中的多态性，在猪苹果酸酶1基因3'UTR长298bp的序列中发现3处突变（C138T、G194T和A239C），它们组成3种基因型（CC GG AA、CT GT AC和TT TT CC），χ2独立性检验结果表明这3种基因型在各品种间差异显著（P＜0.05）。对金华×皮特兰F2资源家系猪进行了该多态片段的基因型鉴定，并分析了不同基因型对猪肉质性状的遗传效应。结果显示，在眼肌p H45min、腿臀肌肉p H45min以及肌内脂肪含量这3个指标上，TT TT CC基因型猪分别比CC GG AA基因型猪高0.19%、0.17%和0.79%，差异显著（P＜0.05）。

本研究的主要目的是通过PCR-SSCP分析，找出苹果酸酶基因在肉羊的遗传变异规律，结合生产性状进行相关分析找出其与生产性能的相关关系，为肉羊的分子育种提供遗传学方面的理论依据。

1．材料和方法

（1） 实验材料

选取4月龄体重相近的南非肉用美利奴和东北细毛羊杂交羊37只，统一标准饲养于吉林省农业科学院畜牧科学分院，颈静脉采血10ml左右，ACD抗凝，-80℃冷冻保存。饲养9个月后进行屠宰，并测定肉质性状。

（2）肉质性状测定

参照《羊生产学》有关方法测定屠宰及肉质性状，屠宰性状为胴体重、净肉重、屠宰率、净肉率；肉质性状主要测定肌肉的宰后45分钟p H值（p H1）、宰后24小时p H值（p H24）、失水率、熟肉率和剪切力。具体方法见第二章。

（3）ME1基因第一外显子多态性检测

主要试剂和仪器设备、DNA的提取与浓度检测、PCR扩增、SSCP检测以及目的片段的克隆与序列测定参考第三章内容。

经过同源比对后参考牛ME1基因序列（登录号：NC_007307）设计ME1基因的引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表11-42 引物的设计

表11-43 ME1基因第一外显子PCR体系

反应条件为95℃预变性 4min；95℃变性40s；59℃退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

( 4 )统计分析

利用SPSS20.0统计软件对不同基因型向各个体性状均值进行差异显著性捡验租多亚比较。

2.结果与分析

( 1 )血液基因组D N A提取检测结果

提取的血液基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰、无拖带、亮度较高，DNA质量完好，可以用于下一步实验。

图11-56 绵羊血液基因组DNA电泳图

（2）ME1基因第一外显子PCR扩增结果

根据设计的引物对ME1基因第一外显子进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现扩增产物的大小预期一致，无非特异性条带，可以用于SSCP分析。

图11-57 ME1基因第一外显子PCR扩增电泳图

（3）PCR-SSCP检测结果及克隆测序结果

PCH产物经1%琼脂辅凝胶电泳检测发现扩地产物的大小与预期一致，元非特异性条带，可以用于SSCP分析。SSCP检测到三种基因型：AA、BB，AB。分别对纯告子AA、BB进行回收、测序、比对。结果发现AA、BB型与参考序列(登录号：NCOO7307)之间存在碱基差异，均存在g.186523C>A突变.基因型AA存g.186524C>l突变；群体内基因型AA、基因型BB之间存在g.186524G>T突变。

图11-58 ME1基因第1外显子SSCP检测及测序比对结果

（4）基因型频率及基因频率

对群体内SSCP分型结果进行统计分析，计算基因型频率和等位基因频率，经卡方检验发现该位点不处于Hardy－Weinberg平衡状态。

表11-44 ME1基因第一外显子基因型频率及基因频率

在屠宰、肉用性能测定的基础上，对不同基因型各性状均值进行了差异显著性检验，结果发现基因型BB的胴体重、净肉重显著高于基因型AA（p<0.05）。在肉质性状的相关分析中，基因型BB的p H1、剪切力性状均值均显著高于基因型AA （p<0.05）；基因型AA的熟肉率均值显著高于基因型BB（p<0.05）。

表11-45 ME1基因各基因型屠宰性状均值差异显著性检验

注：同行中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

表11-46 ME1基因各基因型肉质性状均值差异显著性检验

注：同行中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

3．讨论

关于ME1基因的遗传变异研究报道并不多，李建华等（2008）研究表明，ME1基因在不同绵羊品种中具有单核苷酸多态性，检测发现存在的SSCP多态性是3 个单碱基突变，即碱基C138T、G194T 和A239C 的替换，并认为ME1 基因型对猪肌肉p H45和脂肪沉积有影响。由于绵羊的ME1基因组DNA序列没有发布，所以本研究关于绵羊ME1基因的研究是在比对牛基因序列基础上进行的，所对比结果也是参考牛的基因序列，所以存在的突变数量很多。本研究结果将为更深一步的研究绵羊ME1基因提供一定基础数据。

通过苹果酸酶（ME）的催化作用所形成的NADPH是合成长链脂肪酸所需能量的主要来源，因此苹果酸酶基因是影响肌内脂肪沉积的重要候选基因，Zhang研究表明，增加ME基因表达量会使脂肪酸的生物合成量增加，特别是不饱和脂肪酸含量显著。杨烨等（2011），研究发现，肌肉ME活性与肌肉滴水损失和剪切力呈显著相关。杨海玲等（2005），研究表明猪背膘中ME1的活性比其他脂肪代谢酶的活性高，ME1活性与背膘厚呈极显著相关。张跃等（1992）研究发现猪背膘中ME1活性与猪瘦肉率及背膘厚的相关系数为-0.61和0.36，达到显著水平，认为ME1可能影响猪的脂肪沉积。张凯等（2009）研究表明ME1表达水平的提高促进了脂肪的沉积。

本研究进行了ME1基因多态性与肉用性状的关联分析，并发现了一些与生产性状相关的基因型，基因型BB与胴体重、净肉重、p H1、剪切力显著相关；基因型AA与熟肉率有一定的正相关。这些研究结果可以作为ME1基因在分子育种中应用的参考。