羊的其他繁殖新技术

图2.2.5　羊输精示意图

操作时注意,输精的瞬间要缩小开膣器开张程度,减少刺激,并向外拉1/3,使阴道前边闭合,容易输精。输精完毕母羊在保定位置停留片刻后再将母羊赶走。输精原则为“适时、深部、慢插、轻注、稍站”10个字。

(2)腹腔内窥镜输精法

输精母羊输精前12～24h禁食空腹,手术器械等用具提前用0.1%新洁尔灭液浸泡30 min。把待输精母羊固定在专用保定架上,呈仰卧斜倒立保定,角度为45°～60°。由3人操作,其中手术1人,助手2人。固定好后,剪掉腹中线到乳房前的羊毛,先用碘酊棉球消毒,再用70%的酒精棉球消毒,在乳房前8～10cm处用套管针刺入。再充入适量CO2使其内脏前移并使腹壁与内脏分离,通过刺入套管针,将腹腔内窥镜伸入腹腔,打开光源后观察子宫角及排卵点情况。然后在对侧相同部位,用手术刀片刺开一个小口约1.5cm,借助腹腔内窥镜把卵巢上有黄体发育一侧的子宫角用牵引钳拉出。在子宫角远端1/3处,用消毒好的曲别针扎一小洞,输入解冻好的精液0.1mL。然后放回子宫角并缝合,用碘酊棉球消毒缝合处,臀部肌内注射青霉素160万IU。

【评估考核】

一、名词解释

1.人工授精

2.冷冻精液

3.顶体异常率

二、填空

1.公羊采精频率要根据精子产生_______量、_______量、_______量、_______率、_______率和饲养管理水平等因素来决定。

2.正常羊的精液的精子畸形率一般不超过_______%。

3.羊的精液稀释液的主要成分有:_______剂、_______剂、_______剂及其他添加剂。

4.羊人工授精技术的主要技术环节包括__________、__________、__________ 和__________等。

5.羊人工授精技术的输精方法包括_______和_______。

6.羊人工授精的输精剂量,若是原精液可为_______mL,若是稀释后精液或冷冻精液应为_______mL。

7._______保存法是目前冷冻精液常用的保存方法,其保存温度为_______。

8.精液稀释液的主要成分有__________、__________、__________ 及__________。

9.精液品质检查主要包括 检查_______、检查_______、检查_______三大项目。

三、简答

1.简述绵羊采精前应进行哪些准备工作。

2.简述精液品质检查应检查哪些指标。

3.羊人工授精的输精操作应怎么样进行?

任务二　发情控制技术

【基本概念】

同期发情是指利用外源激素及其类似物对母羊处理,人为地控制并调整一群母羊的发情周期,使它们在特定的时间内集中表现发情并排卵的方法。

诱导发情是对处于乏情状态(生理性或病理性)的成年母羊,用外源激素和某些生理活性物质以及环境条件的改变和异性刺激等方法,使之恢复正常的发情和排卵。

【教学重点】

同期发情的概念、意义及方法与效果。

诱导发情的概念、意义及方法与效果。

【教学目标】

1.知识目标

◆掌握同期发情和诱导发情的基本概念,了解同期发情和诱导发情在畜牧业生产中的重要意义。

◆掌握目前用于同期发情和诱导发情技术的主要激素种类和处理方法。

2.技能目标

◆能够根据生产需要,正确选择用于同期发情和诱导发情技术的主要激素种类,学会同期发情和诱导发情技术的处理方法。

【教学内容】

发情母羊繁殖过程中的一个重要环节,通过人为的方法改变母羊的发情周期,是提高其繁殖率的一个有效途径。使用某些激素或药物以及畜牧管理措施,人工控制母羊个体或群体发情和排卵的技术,称为发情控制,它包括诱导发情和同期发情。前者通常是针对乏情的母羊个体而言,后者则是针对周期性发情或处于乏情状态的母羊群体而言。

一、同期发情

(一)概述

1.同期发情的概念

同期发情是指利用外源激素及其类似物对母羊处理,人为地控制并调整一群母羊的发情周期,使它们在特定的时间内集中表现发情并排卵的方法。同期发情是近年来现代化畜牧业生产中发展起来的新的繁殖调控技术。

2.同期发情的意义

①有利于人工授精技术的推广,促进羊的品种改良,可以促进冷冻精液更广泛应用,使人工授精成批集中进行,改变母羊的发情周期以提高繁殖力。

②有计划、合理地组织配种,为集约化管理带来方便。集约化管理是提高经济效益的重要手段之一,利用同期发情技术有计划、合理地组织配种,使同期出生的幼畜整齐成批培育、出栏,同时使产品均衡地供应市场成为可能。

③它是胚胎移植技术的重要环节。在胚胎移植的应用中同期发情有两方面的意义:其一,受体的发情同期化,即在同一时间内为超排供体或冷冻胚胎准备足够可用于移植的受体;其二,在鲜胚移植中供体和受体的发情同期化,以期达到供、受体处于相同的生理状态。

(二)方法与效果

目前用于同期发情的激素主要有两大类:一类激素属于孕激素,如孕酮及其类似物(18-甲基炔诺酮、氟孕酮)等,这些激素抑制卵泡的生长发育,从而抑制母羊的发情;另一类激素是具有溶黄体作用的激素,如前列腺素(PG)及其类似物。此外,还有一些激素是在这两类激素基础上起辅助作用的促性腺激素,如FSH、LH、PMSG、HCG和GnRH等,它们能促进卵泡发育、成熟和排卵,增强同期发情的效果,提高发情率。

1.孕激素法

孕酮、甲孕酮、氟孕酮、氯地孕酮、甲地孕酮以及18-甲基炔诺酮等均属此类药物。其用药方式有口服法、注射法、耳背皮下埋植法和阴道栓塞法。早期处理方法以口服和注射为主,持续16～20d,因受胎率仅为正常配种的70%,故未能显示其经济效益,没有受到重视。20世纪70年代以后开发了孕激素耳背皮下埋植法和孕激素阴道栓法。这两种方法均能保证孕激素稳定持续释放,在处理时间内能有效地抑制雌性动物发情和排卵。

(1)口服法

每日将一定量的孕激素药物均匀拌入少量精料中,经一定时期后停药。药物用量为:甲孕酮7～8mg/d,甲地孕酮15～20mg/d,氟孕酮2～5mg/d。这种方法可用于舍饲母羊,但要求单个饲喂,连服12～14d,因此费时费工;而群体饲喂会造成个体摄入量不准确,故在生产中一般不采用此方法。

(2)注射法

每日将孕激素药物按口服量的2/3注射到羊的皮下或肌肉内,经一定时期后停药。此法剂量准确,效果可靠。但注射工作繁重且严重惊扰母羊,因此该方法也难以在生产中对大群母羊推广应用。

(3)耳背皮下埋植法

埋植物一般为含有3mg甲基炔诺酮的硅橡胶棒,将其埋植于动物皮下,经一定时间后取出,处理过程中药物被缓慢吸收,可成群处理。生产中一般采用14～18d(绵羊为14～16 d,山羊为18d)的较长时间处理,以期获得较高的发情率和受胎率。孕激素处理结束时,视体重注射350～1000IUPMSG,对促进卵泡发育和发情同期化有一定的作用。孕激素同期发情处理后2～3d的发情率可达90%,但第一个情期的受胎率不高,一般第二个情期的受胎率相对比较正常。

(4)阴道栓塞法

国外现在使用的主要有螺旋状(美式,PRID)和Y状(新西兰式,CIDR)栓塞。国产的多为孕激素海绵栓,内含孕激素,如甲孕酮40～60mg,或氟孕酮30～60mg,或18-甲基炔诺酮30～40mg,或氯地孕酮20～30mg。其制作过程为:先按剂量将孕激素制成悬浮液,取一块经灭菌的海绵浸透药液,拴上细线。使用时用送栓器将海绵栓塞入母羊的阴道深部子宫颈附近将细线引到阴门外,放置14～16d取出;为提高药效,可中途换栓1次。一般撤栓后72h同期发情率可达90%以上。其缺点是:海绵栓容易和阴道内膜发生粘连,造成取栓困难。

2.利用溶黄体的制剂

由于前列腺素及其类似物具有显著的溶解黄体和促进排卵的作用,并且价格较低,因此在羊的同期发情处理中使用较广泛。常用的药物为PGPF2a及其类似物如氯前列烯醇,二者对羊的同期发情效果差异不大。生产中利用PG进行同期发情处理时通常为间隔8～14 d,对母羊2次颈部肌内注射。氯前列烯醇注射剂量为0.1mg。一次用药后的发情率为70%,并且第一情期的受胎率较低,第二情期的集中发情程度高且受胎率正常。PG处理后母羊一般在4d内发情,观察到发情后12h配种。但是绵羊观察到的发情率通常低于实际排卵率,因此在处理结束后48h、72h两次定时输精的受胎率会高一些。

3.配合强化制剂

这类药剂促使母羊同期发情的药物,如果配合使用促性腺激素可以增强发情同期化和提高发情率,促进卵泡更好地成熟、排卵。这类药物有:PMSG、HCG、FSH、LH、LHRH促黄体激素-释放激素。通常应用于同期发情的药物,都需要配合促性腺激素作为强化剂,以增强同期化和提高发情率。一般是在应用抑制卵泡或黄体生理功能正常发育两类药物的基础上,当群体母羊卵巢处于相同生理阶段的基础上,再应用促性腺激素,以提高发情同期化的效果。使用孕激素作同期发情处理的母羊,其第一发情期的配种受胎率较低,但第二发情期的受胎率达到正常水平,其原因是孕激素能影响精子在母山羊生殖道内的运行并使其生活力受到破坏。在停用孕激素后下一个发情期到来之前,配合应用PMSG,可促进受眙率的提高。常用的处理方法有以下4种。

(1)孕激素+PMSG

在母羊发情周期的任何一天埋植孕激素阴道栓,14d后取出,取栓同时肌内注射PMSG,剂量为:绵羊200～250IU,山羊200～300IU。

(2)孕激素+PMSG+PG

母羊阴道埋植孕酮栓16d,可在羊发情周期的任何一天埋植,将埋植之日作为0d,于孕酮栓埋植的第14d,肌内注射PMSG,剂量为200～500IU,在第16d时撤栓,颈部肌内注射PG,剂量为0.1mg。河北省牛羊胚胎工程技术研究中心利用孕激素+PMSG+PG法对2100余只本地山羊进行了同期发情处理,其中72h同期率90.9%。此种方法最大的优点是发情集中程度高,24h同期率可达64.6%,并且不受季节和地区的影响。

(3)孕激素+FSH

在母羊发情周期的任何一天埋植孕激素阴道栓,将埋植之日作为0d,于孕酮栓埋植的第13d,肌内注射FSH25～50IU,第14d撤栓。

(4)三合激素

由于三合激素中含有较高的雌激素,处理后虽有发情表现,但可能不排卵造成受胎率极低,因此必须与促性腺激素配合使用才能达到理想效果。具体方法是:母羊第一次肌内注射三合激素1.0～2.0mL,试情但不配种,间隔14d,第二次肌内注射三合激素0.5～1.0mL,同时注射PMSG150IU和LRH-A250ug(或FSH20IU)。

二、诱导发情

(一)概念

对处于乏情状态(生理性或病理性)的成年母羊,用外源激素,如促性腺激素、雌激素或前列腺素等生殖激素和某些生理活性物质(如初乳)以及环境条件的改变和异性刺激等方法,使之恢复正常的发情和排卵,这种技术称为诱导发情,也叫诱发发情。

(二)意义

1.提高母羊的繁殖率

诱导发情可以打破多数羊的季节性繁殖规律,控制母羊的发情时间、缩短繁殖周期、增加胎次和产仔数,使其所产后代增多,从而提高繁殖力。

2.提高养羊业的经济效益

诱导发情可以调整母羊的产仔季节,使奶羊在一年内均衡供奶,肉羊按计划出栏,根据市场需求供应畜产品,从而提高经济效益。

3.提高母羊的繁殖潜力

诱导发情可使母羊在任何季节发情,故可根据母羊生长状况,确定适宜的配种计划,避免因配种措施不当而引起的不良后果,便于实施有计划羊生产目标,提高母羊繁殖潜力。

4.治疗生理性或病理性原因导致的母羊不孕

在生产实践中,有些母羊往往由于卵巢静止或有持久黄体存在而长期处于乏情状态,用外源性激素或某生理活性物质诱导发情,可起到良好的治疗效果,从而提高母羊的利用效率。

(三)羊诱导发情方法与效果

处于乏情状态的绵羊,不管是泌乳性乏情还是季节性乏情,卵巢上都无发育成熟至排卵的卵泡,也无功能黄体存在。这种情况下,利用外源生殖激素(神经生殖激素、促性腺激素、性腺激素)或人工创造适宜气候环境或公畜效应等方法引起内源促性腺激素分泌与释放,可使卵巢恢复活动,引起卵泡发育成熟至排卵。

1.利用生殖激素诱导母羊发情

用于诱导母羊季节性乏情及产后乏情有关的生殖激素主要是:褪黑激素(MLT)与促性腺激素释放激素(GnRH);垂体促性腺激素促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素(PMSG)、孕激素、雌激素。

(1)褪黑激素(MIL)诱导法

褪黑激素的给药途径有注射法、口服法、埋植法和阴道海绵栓法。其中埋植法可使血浆中褪黑激素水平持续升高,持续时间可达几周,且方法简单易行,阴道海绵栓也可使褪黑激素持续释放。对于羊来说,也可将瘤胃作为激素释放的一个理想空间。如在瘤胃内放置一个特制的小球,使褪黑激素持续不断地向瘤胃中释放,然后被吸收进入血液循环。此种小球最终可在瘤胃中被降解消失。

(2)促性腺激素诱导法

Mielniczuk—M等(1996)应用FGA海绵栓处理14d后,移去海绵栓后随机分成3组(第一组肌内注射PMSG500U,第二组肌内注射PMSG50U,第三组为对照组)在配种后第18d检测血液中孕激素水平判断的妊娠率分别为67.7%、63.3%、20.0%,也就是说肌内注射PMSG50U与500U差异不显著,但二者与对照组差异显著。可见,PMSG作为卵泡发育的一个引发因素,对生理性乏情母羊诱导发情是必需的。

(3)性腺激素诱导法

生产中主要用雌二醇(2～5mg/只)和己烯雌酚(10～15mg/只)。肖鸿展等(1997)对滩羊诱导发情,采用皮下埋植法,撤管前48h注射PMSG.撤管时注射乙烯雌酚,此时发情受配率低,为加强发情表现,取管后14d全部注射已烯雌酚,发情受配率达90%。

2.“公羊效应”诱导法

“公羊效应”实质是公羊分泌的外激素对母羊感觉器官产生刺激,经神经系统作用于下丘脑-垂体-性腺轴,即激发LH释放,作用于卵巢,引起发情、排卵。公羊刺激母羊的能力在公羊个体间有差异,并且随季节而变化,这可能与睾酮产生季节性变化有关。公、母羊间的刺激也是相互的,公羊诱导母羊发情,发情的母羊强化公羊的“公羊效应”。母羊经公羊诱导后的反应因不同品种、不同乏情程度而不同。诱导后的首次排卵多无发情征状,部分母羊排卵后形成黄体,多为短寿命黄体,5～6d后即退化,随后出现第二次发情。乏情程度越严重,首次诱发排卵的发情率越低,短寿命黄体的发生率越高。孕酮阴道栓或埋植孕激素12～ 16d与公羊效应共同作用可防止黄体提早退化,减少短寿命黄体发生率。在初情期或乏情期内,公羊必须与母羊完全隔离一段时间,绵羊至少4周,然后放入母羊群内,公羊效应才能发挥。

3.利用控制光照时间诱导法

季节性乏情主要是因为光照造成,春夏季是母羊的乏情季节,可通过创造人工气候环境来实现诱发发情。人工缩短光照时间,模拟秋季每日光照8h、黑暗16h,改变母羊的环境条件,引起内源性促性腺激素分泌,使卵巢恢复活动,一般处理7～10周后开始发情,5月份进入发情旺季,可得到80%左右的诱导发情效果。但是这种方法需要一定的设备和费用,在生产中难以采用。

【评估考核】

一、名词解释

1.同期发情

2.诱导发情

3.季节性乏情

二、填空

1.羊的同期发情处理中溶黄体的制剂常用的药物为_______及其类似物_______。

2.利用孕激素法进行羊的同期处理,其用药方式有______________、______________ 和_______及_______等,其中早期处理方法以_______和_______法为主。

3.羊的季节性乏情主要是因为_______造成,_______季是母羊的乏情季节。

三、简答

1.简述羊引导发情技术应用的意义。

2.简述羊常用的同期发情方法及其效果。

任务三　排卵控制技术

【基本概念】

超数排卵简称“超排”,是指在母羊发情周期的适当时间,施以外源性促性腺激素,使卵巢中比自然情况下有较多的卵泡发育并排卵的技术。

诱导排卵是指控制排卵时间或者因某些原因不能正常排卵的性成熟母畜排卵的技术。

【教学重点】

超数排卵和诱导排卵的基本概念,母羊超数排卵和诱导排卵的方法与效果。

【教学目标】

1.知识目标

◆掌握超数排卵和诱导排卵的基本概念,了解超数排卵和诱导排卵在畜牧业生产中的重要意义。

◆掌握目前用于超数排卵和诱导排卵技术的主要激素种类和处理方法。

2.技能目标

◆能够根据生产需要,正确选择用于超数排卵和诱导排卵技术的主要激素种类,学会超数排卵和诱导排卵的处理方法。

【教学内容】

一、超数排卵

(一)概述

1.基本概念

超数排卵简称“超排”,是指在母羊发情周期的适当时间,施以外源性促性腺激素,使卵巢中比自然情况下有较多的卵泡发育并排卵的技术。

2.意义

(1)胚胎移植的关键技术

超排是获得胚胎的关键环节,可为胚胎移植提供大量可用胚胎,其效率的高低是制约胚胎移植捷术发展的关键因素,直接影响胚胎的生产数量和胚胎的生产成本。

(2)充分发掘优良母羊的繁殖潜力,加速品种改良

通过超排处理后,人工回收卵母细胞,经培养成熟,使之受精而形成胚胎,这将会开发利用卵巢上的卵母细胞资源,大大提高优良母羊的繁殖效益,对利用其高产基因和加速品种改良以及加快育种步伐具有重要的意义。

(3)为胚胎生物技术研究提供更多可用资源

在自然条件下,母羊一生中卵泡数量在20～40万个,而最终能排卵的仅占极少数部分,大部分细胞在发育的不同阶段闭锁消失应用超排技术可使每次的排卵数量大为增加,从而为胚胎工程等方面的研究提供更多可用资源。

(4)为应用性控精液产双羔提供技术支撑

目前,利用流式细胞分离仪已能大批量生产性控精液,与超数排卵技术相结合,可使母羊产双羔,从而显著提高繁殖效率和生产效益。

(二)成年母羊超数排卵的方法及效果

1.绵羊超排方法及效果

(1)FSH+PG法

在发情周期第12d至第13d开始肌内注射(或皮下注射)FSH,以递减剂量连续注射3 d,6次,每次间隔12h,第5次注FSH同时肌内注射PGF2a0.2mg。国产FSH总剂量为150～300单位,全部注射完后随即每天上、下午试情,超排处理母羊发情后立即静脉注射LH 100～150单位(有的用60ugLRH代替LH,获得同样的效果),有的不主张注射LH。

(2)PMSG法

在发情周期的12～13d,1次肌内注射(或皮下注射)PMSG800～1500单位,出现发情后或配种当日肌内注射hCG500～750单位。

(3)孕激素(CIDR)+FSH+PGF法

供体羊阴道中放入第1个CIDR,10d后取出第1个CIDR,同时放入第2个CIDR,第5d开始注射FSH,连注4d共8次,在第7次注射FSH时取出第2个ClDR,并肌内注射PGF,一般取CIDR后24～48h发情。或给供体羊在阴道内放入CIDR,在埋栓的第9d开始肌内注射FSH,共4d8次,在第7次注FSH时取出CIDR,并肌内注射PGF,取CIDR后24～48h发情。

(4)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)+FSH法

据曾培坚、石国庆等(1997)报道,分别用7.5mg(中科院动物所产)、250单位、300单位(武汉生物制药厂产)FSH溶于10mL、15%PVP,于性周期12～13d对中国美利奴羊军垦型9岁淘汰母羊进行一次超排处理,羊发情后的第5～6d进行手术采卵,结果头均胚胎分别为5.0、4.67、5.0枚。

(5)抑制素免疫法

供体进行抑制素免疫后,所产生的抗体中和了外周血浆中的抑制素,减弱了其对垂体的负反馈作用,从而使FSH分泌增加,促进卵泡发育并提高了排卵率。

2.山羊超排方法及效果

(1)孕激素+FSH+PGF2a法

在供体羊发情周期的任意一天,阴道放入第1个阴道栓(CIDR),于第10d取出并放入第2个阴道栓,在放入第2个栓的第5d开始连续4d肌内注射FSH(每天2次,间隔12h), 第8d撤栓并同时注射PG,发情后输精或配种,配种后第6d手术采集胚胎。

(2)PMSG法

在发情周期的16～18d开始,总剂量800～1500单位,方法同绵羊。

(3)FSH+PMSG

于第1次注射FSH的同时,加注PMSG200单位。

(4)孕激素+PMSG+APMSG法

撤去孕酮阴道栓前的第36d给山羊注射1000单位PMSG,在撤栓后的第28d静脉注射PMSG抗体(APMSG)。

(5)FSH+GnRH法

Akinlosotu等(1993)用FSH对山羊进行超排处理时,在发情开始时给予一定量的GnRH可以减少胚胎回收时不排卵大卵泡数量的出现,不但提高了胚胎质量,而且提高了可用胚数和受胎率。Fry等(1999)在牛的试验中报道,超排时用促性腺激素刺激72h后,给予一定量的GnRH可大大增加卵巢上直径≥5mm的卵泡数量,提高了超排效果。

二、诱导排卵

(一)概述

1.基本概念

控制排卵时间或者因某些原因不能正常排卵的性成熟母畜排卵的技术,称诱导排卵。在生产实践中,多数情况是在同期发情的情况下实施诱导排卵,即同期排卵。

2.意义

(1)准确控制排卵时间,更好地掌握配种时机,提高繁殖率

利用外源激素代替体内激素以促进卵泡成熟和排卵,可以较准确地判断排卵时间,便于更好地掌握配种时机,提高受胎率。

(2)可对群体集中处理,节省人力物力财力,提高生产效益

现代畜牧生产要求规模大、集约化,母畜同期排卵后可同期配种,随后的妊娠、分娩、产仔及仔畜的管理等一系列饲养管理环节都可有计划地进行,从而降低成本,提高效益,形成规模生产。

(3)使不能正常排卵的卵泡排卵

因某些疾病家畜卵巢上的优势卵泡不能正常排卵,造成母畜卵巢囊肿,引发持续发情。通过外源激素诱导可使其卵泡破裂、排卵,并消除卵巢囊肿。

(二)母羊诱导排卵方法与效果

绵、山羊发情有明显的季节性,一般集中在8—10月,空怀期长达9个月,严重影响了羊的产业化生产。繁殖活动受生殖激素的调节与影响,当内源性生殖激素不足以使卵巢活动恢复时,可应用GnRH、FSH和PMSG等外源性激素诱导卵泡生长发育并成熟排卵,可达到或超过繁殖季节的繁殖效果。

①注射GnRH最常见的诱导排卵激素为促性腺激素释放激素(GnRH或LRH)。目前,通过人工方法合成多种类似物,国产的LRH-A2(促排2号)、LRH-A3(促排3号)等,其生物学活性比天然GnRH高10～15倍。Khalid,basiouni等(1997)对乏情母羊注Gnrh250mg,卵巢上直径小于2.0mm的卵泡减少,大于5.0mm的卵泡明显增多桑润滋等(1995)报道,在给河北细毛羊输精的同时肌内注射LRH-A340～80ug,结果情期受胎率比对照组提高6.3%～27.2%。桑润滋等(2003)报道,在超排波尔山第1次配种的同时肌内注射LRHA315ug,试验组头均可用胚数为15.40±8.28枚,而对照组分别为12.16±68枚,差异显著。

②注射促性腺激素PMSG、FSH顾玉兰等(2006)用PMSG诱导新疆军垦细毛羊、哈萨克羊、湖羊的发情排卵。海绵栓放置13d,13d上午撤栓,同时肌内注射400单位PMSG。试验结果表明,哈萨克羊、新疆军垦细毛羊和湖羊的排卵率分别为94.28%、95.08%和98.46%,卵巢黄体平均数分别为1.192、1.233和3.172个。张永固等(2005)报道,繁殖季节60单位FSH和非繁殖季节70～80单位FSH处理能有效地诱导滩羊的同期发情,并增加母羊的排卵数。

【评估考核】

一、名词解释

1.超数排卵

2.诱导排卵

3.同期排卵

二、填空

1.绵羊超数排卵的方法主要由_______法、_______法、_______法、_______法及抑制素免疫法五种。

2.绵羊诱导排卵的方法主要由注射_______和注射_______两种。

三、简答

1.简述羊超数排卵技术应用的意义。

2.简述成年母羊超数排卵的方法及其效果。

任务四　胚胎移植技术

【基本概念】

胚胎移植是将体内、外生产的羊的早期胚胎,移植到另一头生理状态相同的母羊生殖道内,使之继续发育成为新个体。

【教学重点】

胚胎移植的技术的主要操作程序。

【教学目标】

1.知识目标

◆掌握胚胎移植的概念,了解胚胎移植技术在畜牧业生产中的重要意义。

◆掌握胚胎移植的生理学基础和胚胎移植的原则。

◆了解胚胎移植的技术的主要操作程序。

2.技能目标

◆根据胚胎移植的原则,能够进行供体和受体的正确选择,学会胚胎移植技术的主要操作方法。

【教学内容】

一、基本概念

胚胎移植(ET)也称受精卵移植。其含义是将体内、外生产的羊的早期胚胎,移植到另一头生理状态相同的母羊生殖道内,使之继续发育成为新个体,又称之为借腹怀胎。提供胚胎的个体称为供体,接受胚胎的个体称为受体。胚胎移植实际上是产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代的过程。

二、意义

如果说人工授精是提高良种公羊配种效率的有效方法,那么胚胎移植则为提高良种母羊的繁殖力提供了新的技术途径。胚胎移植和人工授精是分别从母羊和公羊两个方面提高繁殖力的有效方法,同时也是进行育种工作的有效手段。目前,胚胎移植的意义体现在以下6方面:

1.充分发挥优良母羊的繁殖潜力,提高繁殖效率

作为供体的优良母羊,通过超数排卵处理,一次即可获得多枚胚胎。所以,不论在一次配种后或从其一生来看,它都能产生更多的后代,比在自然状态下增加若干倍。

2.缩短世代同隔,加快遗传进展

通过超数排卵和胚胎移植技术(MOET)可使供体繁殖的后代增加7～10倍。在育种工作中应用MOET,可以加大选择强度和提高选择准确性,并缩短世代间隔,对于加快遗传进展尤为重要。

3.诱导肉羊怀双胎,提高生产效率

在肉羊业中,给未配种的母羊移植2枚胚胎,也可给已配种的母羊(排卵的对侧子宫角)再移植1枚胚胎,这样可提高受体母羊畜的受胎率和双胎率。目前,此项技术的双胎率可达30%～70%,生产效率大为提高。

4.代替种羊的引进

胚胎的冷冻保存可以使胚胎的移植不受时间和地点的限制,通过胚胎的运输代替种羊的进出口,节约购买和运输种羊的费用。此外,通过引进胚胎进行繁殖的羊,由于在引入地生长发育较容易适应本地区的环境条件,也可从受体羊得到一定的免疫力。

5.保存品种资源

胚胎冷冻技术是保存某些特有羊品种的理想方式,可把优良品种的胚胎贮存起来,还可以避免某一区的良种因遭受自然灾害或战争造成的绝种。同时,比保存活羊的费用低廉且容易实行。

6.使不孕母羊获得生殖能力

有些优良母羊容易发生习惯性流产或难产,或由于其他原因不宜担负妊娠过程的情况下(如年老体弱),可让其专作供体,繁殖后代保留其优良性状。对母羊由于输卵管堵塞或有炎症不能受胎时,也可作为受体,正常妊娠产仔。

三、胚胎移植的生理学基础

1.母羊发情后生殖器官的孕向发育

母羊发情后,不论是否配种或者配种后卵子是否受精,生殖器官都会发生一系列变化,如卵巢上出现黄体,孕激素大量分泌并维持在较高的水平。在孕激素的作用下,子宫内膜增厚,子宫腺体发育且分泌活性增强,子宫蠕动减弱,子宫颈被黏稠分泌物封闭,这些变化都给早期胚胎发育创造了良好环境。在自然状态下,母羊发情、配种、受精和妊娠是连续的、不间断的、有规律性的生理现象。因此,母羊在发情后数日内,无论生殖道内有无胚胎存在,生殖系统的变化都是相同的;在相同发情时期内,母羊的生理状态是基本相同的。在妊娠识别发生之前,胚胎只要其发育阶段与受体母羊发情时期相对应,移植到受体后就可以继续发育为完整胎儿。

2.早期胚胎的游离状态

胚胎在附植之前一般处于游离状态,从输卵管移行到子宫角,发育需要的营养主要来源于自身贮存物质以及输卵管、子宫内膜分泌物,胚胎与子宫未建立组织联系。这一特性是胚胎采集、保存、培养和体外操作的重要理论基础。

3.子宫对早期胚胎的免疫耐受性

在妊娠期,由于母体局部免疫发生变化以及胚胎表面特殊免疫保护物质的存在,受体母羊对同种胚胎、胎膜组织一般不发生免疫排斥反应。所以,在同种动物体内,胚胎从一个母体子宫或输卵管移入到另一个母体子宫或输卵管,不仅能够存活下来,而且还可与子宫内膜建立密切的组织联系,保证胎儿健康发育。

4.胚胎遗传物质的稳定性

胚胎遗传信息在受精时就已确定,以后的发育环境只影响其遗传潜力的发挥,而不能改变它的遗传特性。因此,胚胎移植后代的遗传性状由供体母羊及与配公羊决定,代孕母体仅影响其体质的发育。

四、胚胎移植的原则

1.胚胎移植前后环境的同一性

同一性的原则要求胚胎的发育阶段与移植后的生活环境相适应,如果胚胎发育阶段与所处的环境不统一,胚胎将不能正常发育或使母体的妊娠识别失败。因此,在胚胎移植时,应根据物种和胚胎发育阶段确定移植在受体生殖道内的解剖位置。如羊16细胞之前胚胎通常移入输卵管中,而桑葚胚以后的胚胎需要移入子宫角。在胚胎移植实践中,胚胎发育阶段与受体的同步差不能超过±1d,同步差越大,受胎率越低。

2.胚胎发育阶段

胚胎移植的理想时间应在妊娠识别发生之前,通常是在供体发情配种后3～8d采集胚胎,受体也在相同时间接受胚胎移植。

3.胚胎质量

胚胎质量与妊娠信号分泌的强弱以及后期发育潜力直接相关,只有形态、色泽正常的胚胎移入受体后才可使受体子宫顺利进行妊娠识别和胚胎附植,最终完成体内发育;而质量低劣的胚胎在发育中途便退化,导致妊娠识别和胚胎附植失败、早期胚胎丢失或流产。因此,胚胎在移植之前需要进行严格的等级鉴定。

4.经济效益或科学价值

应用胚胎移植技术时必须考虑成本和最终收益。通常,供体胚胎应具有独特的经济价值,如生产性能优异或科研价值重大,而受体生产性能一般但繁殖性能良好,环境适应能力强。

五、胚胎移植的技术方法

胚胎移植的技术程序包括:供、受体选择,供、受体同期发情处理、超数排卵、供体的配种、胚胎采集、胚胎的检查与鉴定、胚胎的移植等。

1.供体的选择

①供体应具备遗传优势,在育种上有价值,应选择生产性能好、经济价值高的羊作为供体。

②供体应具有良好的繁殖能力。供体既往繁殖史好、易配易孕,繁殖史上没有遗传缺陷,分娩顺利,无难产或胎衣不下现象,生殖器官无繁殖疾病,发情周期正常、发情征兆明显。

③供体营养良好,体质健壮,健康无病。

2.受体的选择

受体母羊可选用非优良品种的个体或地方品种应具有良好的繁殖性能和健康状态,体型中上等。在拥有大量母羊的情况下,可以选择自然发情与供体发情时间相同或相近的母羊,一般两者发情时间差不宜超过±24h。由于往往不易找到足够的合适的母羊作为受体,所以大都需要对供体和受体进行同期发情处理。

3.供、受体同期发情处理

见发情控制技术。

4.供体发情鉴定与配种

超排处理后,要密切观察供体羊的发情征兆。在胚胎移植实践中,发情鉴定方法主要以接受爬跨站立不动为主要判定依据。每天早、中、晚对供体认真观察3次,第一次观察到接受爬跨而站立不动的时间即是配种的参考点,此时为0时,由于超排处理后排卵数较正常发情供体多且排卵时间不一致,再加上精子和卵子的运行受超排处理的影响,为确保卵子受精,常采取增加输精次数,加大每次输精剂量的方法。

5.采集时间的确定

胚胎的采集又叫胚胎的收集,也称采胚、冲胚、采卵或冲卵。胚胎的采集就是利用冲胚液将胚胎由生殖道(输卵管或子宫)中冲出,并收集在器皿中。胚胎采集有手术和非手术两种方法。前者适用于各种家畜,后者仅适用于牛、马等大型家畜,且只能在胚胎进入子宫角以后进行。目前,生产中羊胚胎的采集通常采用手术法。

采胚时间要考虑到配种、排卵的大致时间,胚胎的运行速度和胚胎在生殖道的发育速度等因素。只有这样,才能适时、准确地进行操作,得到较高的采胚率。

采胚时间不应早于排卵后的第1d,亦即最早要在发生第1次卵裂之后,否则不易辨别卵子是否已受精。一般是在配种后3～8d,胚胎发育至4～8细胞以上时为宜。

6.羊的手术法胚胎采集

羊手术采(冲)胚大多在供体羊发情配种后的2～6d进行。

(1)输卵管采胚法

将冲胚管(内径为2mm的塑料导管)一端由输卵管伞部的喇叭口插入2～3cm深,用钝圆的夹子固定,另一端接集胚皿。用10mL或20mL注射器吸取37℃的冲胚液5～10mL,在子宫角靠近输卵管的部位,将针头向输卵管方向扎入,一人操作时,一只手在针头后方捏紧子宫角,另一只手推压注射器,使冲胚液由子宫与输卵管结合部流入输卵管,经输卵管流入集胚皿。

该法的优点是胚胎回收率高,冲胚液用量少,检卵省时间;缺点是容易造成输卵管特别是伞部的粘连和损伤,甚至影响繁殖能力。

操作注意事项:第一,针头从子宫角进入输卵管时必须仔细。要看清输卵管的走向,留心输卵管与周围系膜的区别,只有针头在输卵管内进退通畅时,才能冲胚。第二,冲胚时要注意将输卵管,特别是针头插入的部位尽量撑直,并保持在一个平面上。第三,推注冲胚液的力量和速度要持续而适中,过慢或停顿易使胚胎滞留在输卵管弯曲和皱襞内,影响胚胎回收率;用力过大,可能造成输卵管壁的损伤,可能使固定不牢的冲胚管脱落和冲胚液倒流。第四,冲胚时要避免冲胚的针头刺破输卵管附近的血管,把血带入冲胚液,给检胚造成困难,故冲胚管的针头稍钝些为好。

(2)子宫采胚法

该法分为导管法和冲胚管法两种。

①导管法。导管法又可分为两种:第一种方法是:术者将羊子宫暴露于创口外,肠钳(套上胶皮套)夹在子宫角分叉处,注射器吸入37℃的20～30mL冲胚液(一侧多的可用液50～ 60mL),用钝性针头从一侧子宫角尖端插入,推注冲胚液,将回收胚针头从肠钳钳头基部的上方扎入,冲胚液经导管收集于集液杯内。另一侧子宫角用同样方法冲洗。第二种方法是:在一侧子宫角的顶端靠近输卵管的部位用钝的针头刺开一个小口,然后由此口插入冲胚管并使之固定,冲胚管下接集胚管。在子宫角与子宫体相邻的远端将装有37℃的20～30mL冲胚液的注射器插入,针头后方的子宫角用手指捏紧,迅速推注冲胚液,使之经过子宫角流入集胚管。另一侧子宫角用同样方法冲洗。后法也可由2人配合进行。工作人员甲自子宫角近输卵管的一段插入一个连有12号针头的注射器,封死子宫向输卵管的通路,在工作人员乙推冲胚液的同时,甲抽拉注射器,使子宫角内形成负压,这样配合得当,冲胚液易携同子宫内的胚胎一并进入甲的注射器中。子宫采胚法对输卵管的损害甚微,尤其不涉及伞部,但其缺点是胚胎回收率较输卵管采胚法低,用液较多,检胚费时。

图2.2.6　羊二路式冲胚管剖面结构

A.气路　B.水路　1.进出水路　2.气囊　3.进出水通道

②冲胚管法。冲胚管法有两种。一种方法是:手术暴露子宫,在一侧子宫角基部扎孔,将冲胚管(二路式冲胚管剖面结构如图2.2.6所示)插入。用注射器注入气体5～10mL,使气囊在子宫角基部固定,然后由冲胚管进液孔,分次进液冲洗子宫角,每次进液10～20 mL,一侧用液50～60mL,将回收液接于平皿中。用同样的方法冲洗另一侧子宫角。另一方法是:术者先在暴露的一侧子宫角基部,用止血钳或镊子等穿透子宫角壁,然后将冲胚管插入子宫角方向,根据子宫角基部内径的大小经冲胚管的气路给冲胚管充气5～10mL,鼓起气囊使之固定,以起到阻止冲胚液流入阴道内的作用。冲胚管末端接集胚皿。再在子宫角尖端用套管针插入子宫角腔内,拔出针芯,接上装有37 ℃20～40mL冲胚液的注射器,注入冲胚液进行冲胚(注意:注射器推动时稍有阻力,匀速注入冲胚液)。集胚皿要端平,将冲胚管的水道放在集胚皿中。冲胚液注完后拔出套管针,待冲胚液将近流尽时,用拇指、食指和中指稍挤压子宫角让冲胚液尽量流尽。然后给冲胚管放气,拔出冲胚管,并将其中的冲胚液挤入集胚皿中。用同样方法冲取另一侧子宫角内的胚胎(见图2.2.7)。然后在子宫角尖端、子宫角基部及其他部位涂上碘甘油或灭菌液状石蜡,防止粘连。把子宫送回腹腔内。

图2.2.7　羊冲胚管法冲胚示意图

操作注意事项:第一,在子宫角尖端插入套管针或其他冲胚管时,确定确实插入子宫角腔内再注射冲胚液,以免冲胚液注入到子宫浆膜与黏膜之间,使冲胚失败;第二,冲胚管气囊大小要合适,气囊太小起不到固定和阻止冲胚液流入阴道内的作用,气囊太大会使子宫壁受压过大而损伤,并且此处的气囊易坏;第三,注入冲胚液时一定要匀速推注,阻力大时要调整套管针的位置或冲胚管的位置使之通畅。

7.胚胎检查与鉴定

(1)胚胎检查方法

胚胎的检查和鉴定是两个不同的概念。胚胎的检查是指在立体显微镜下,从冲胚液中寻找胚胎。胚胎的鉴定则是将检查的胚胎应用各种手段对其质量和活力进行评定(或等级分类)。

为了减少体外不利因素对胚胎造成的影响,从母羊生殖道冲出来的冲胚液应保持在37℃环境中,冲胚结束后将冲胚液置于30℃的无菌箱中,最好在箱内检查,如果条件不具备,可在20～25℃的无菌操作室内检查。为了缩短检胚时间,最好用2～3台立体显微镜同时检查。因冲胚液量比较大(几百毫升),全部检查花费时间太多,故采取两种方法,既不让胚胎丢失又能节省时间。一种方法是静置法:把盛冲胚液的容器在无菌室内静置20～30 min,胚胎下沉到容器底部,然后将上面的冲胚液吸出,剩下几十毫升即可,然后将这些冲胚液倒入平皿或表面皿,在立体显微镜下检查,为防止胚胎黏到容器上,要用冲胚液冲洗容器,这部分单独倒入平皿检查。另一种方法是采用带有网格(直径小于胚胎直径)的过滤器放入冲胚液中,由上往下吸出冲胚液,最后剩下几十毫升即可,为防止胚胎吸附在过滤器上,用冲胚液反复冲洗过滤器。按上述方法进行处理后,在体视镜下观察,绵羊早期胚胎的直径为150μm左右。检查出的胚胎用吸胚器移入含有20%犊牛血清的PBS中进行鉴定。

图2.2.8　胚胎品质的衡量示意图

胚胎一般分为A、B、C、D四个等级,等级示意图如图2.2.8所示。

①A级。胚胎发育阶段与胚龄一致,胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,无游离的细胞液泡或很少,变性细胞比例<10%。

②B级。胚胎发育阶段与胚龄基本一致,轮廓清晰,分裂球大小基本一致,色调和透明度及细胞密度良好,可见到一些游离的细胞和液泡,细胞占10%～30%。

③C级。胚胎发育阶段与胚龄不太一致,轮廓不清晰,色调变暗。结构较松散,游离的细胞或液泡较多,变性细胞达30%～50%。

④D级。有碎片的卵、细胞无组织结构,变性细胞占胚胎大部分,约75%。

A、B、C级胚胎为可用胚胎,D级为不可用胚胎。

(2)胚胎的评定

移植前正确鉴定胚胎的质量,是移植能否成功的关键之一。目前鉴定胚胎质量和活力的途径主要以形态学方法为主,一般是在50～80倍的实体显微镜下或120～160倍的生物显微镜下进行综合评定,评定的主要内容是:

①卵子是否受精。未受精卵的特点是透明带内分布匀质的颗粒,无卵裂球(胚细胞)。

②透明带的规则性。即形状、厚度、有无破损等。

③胚胎的色调和透明度。

④卵裂球的致密程度,细胞大小是否有差异以及变性情况等。

⑤卵周间隙是否有游离细胞或细胞碎片。

⑥胚胎本身的发育阶段与胚胎日龄是否一致,胚胎的可见结构,如胚结(内细胞团)、滋养层细胞、囊胚腔是否明显可见。

应该指出,形态鉴定在很大程度上是凭经验进行鉴定,因此往往也带有一定的主观性。另外,细胞的形态和内在的生命力并不完全存在必然的相关性,单靠胚胎的形态不能完全说明其活力。但是由于形态鉴定胚胎方法简单易行,如果观察者经验丰富,此方法还是相当可靠的。由于形态学鉴定胚胎有上述优点,在胚胎移植实践中广泛采用。

目前胚胎鉴定的方法除形态学方法外,还有体外培养法、荧光(活体染色)法、测定代谢活性和胚胎的细胞计数等方法,但因设备投入大,测定复杂,在生产实践中应用较少。

8.胚胎移植操作方法

胚胎移植(ET)也叫胚胎的植入,是整个胚胎移植技术中的关键环节之一。所以,一定要按照胚胎移植的规程操作。胚胎移植操作有手术法和非手术法两种。最早采用手术法移植其妊娠率较高,近年来由于移植器械的改进和移植技术的提高。

(1)手术法胚胎移植

手术法移植分为输卵管移植和子宫移植两种。受体羊的术前准备和手术操作同供体羊。吸胚胎时,先用检胚吸管吸入一段培养液,再吸一个小气泡,然后吸取胚胎,胚胎吸取后再吸一个小气泡,最后吸一段培养液。这样,可以防止移动吸管时丢失胚胎。

①输卵管移植。将卵巢上有黄体的一侧或黄体好的一侧的输卵管引出,找到喇叭口并固定好,将吸有胚胎的移植枪头由喇叭口插入2cm,注入胚胎。输卵管移植可直接使用检胚吸管如图2.2.9所示。按输卵管移植的方法吸取胚胎后插入喇叭口如图2.2.10所示,把胚胎送入输卵管。也可用一个截断的12号针头,接一段外径1～1.5mm的塑料软管或硅胶管,再接在1mL的注射器上吸取和移植胚胎。然后,把输卵管送回腹腔内。

图2.2.9　检胚吸管

1.吸管　2.乳胶管　3.玻璃珠

图2.2.10　山羊手术法

A.子宫移胚器　B.将胚胎移入子宫　C.将胚胎输卵管1.移植叶　2.硅胶管　3.吸有胚胎的移胚管

输卵管移植前要注意:输卵管前接近伞部处往往因输卵管系膜的牵连形成弯曲,不利于移胚。因此,术者应使伞部的输卵管处于较直的状态,以使牵出的输卵管部分处于输卵管系膜的正上面,术者能见到喇叭口的一侧。此时,术者将移胚管前端插入输卵管内,然后缓缓加大移胚管内的压力,把带有胚胎的保存液输入输卵管内。若移胚管内液体过多,则多量的液体进入输卵管时会引起倒流,易导致胚胎流失。输卵后一定要保持输卵时的指压,抽出移胚管。若在输卵管内放松移胚管的指压,移胚管内的负压就会将输卵管内的胚胎再吸出来。为了保证移胚确实,移胚后还要再镜检移胚管,观察是否还有胚胎的存在,若没有则说明已移入,就可将输卵管等送回腹腔。

②子宫移植(包括腹腔镜移植)。将卵巢上有黄体的一侧或黄体好的一侧的子宫角尖端固定好,用曲别针钝头等细钝性物在子宫角上1/3无血管处刺透子宫角壁,然后将移植枪头从针孔插入子宫腔内,摆动枪头,确认枪头在子宫腔内时,推动连接移胚管的注射器活塞注入胚胎,然后撤出移胚管,最后把子宫角送回腹腔内。

③腹腔镜手术移植。腹腔镜的主体是观察镜(望远镜和内窥镜)镜筒、光导纤维和光源系统。另外,配有组合套管和针以及送气、排气、照相、电视监测及录像系统等附件。由于内窥镜可以插入腹腔,直接观察腹腔内脏器,因此在兽医临床上常用以检查卵巢、子宫的状态,并配合其他技术,进行活体采卵、输精和胚胎移植等。羊的胚胎移植可用腹腔镜进行。对受体羊停饲8～12h,术前进行全身麻醉或局部麻醉,仰卧保定(应使羊头部斜向下方,后躯抬高,以便更好地暴露生殖器官)。检查术部,按外科手术方法除毛消毒,在耻骨前缘腹中线旁两侧皮肤上各做一个小切口。在一个切口内将消毒套管针穿过切口刺入腹腔,接上送气胶管后向腹腔内轻轻打气,压迫胃肠前移,拔出套管针内芯后,向导管针外壳内插入内窥镜,接上光源后即可对卵巢进行搜索观察。在另一个切口内插入手术钳或卵巢固定钳或拨棒等帮助寻找卵巢。找到卵巢后观察其上面有无黄体,有黄体者就将该侧的输卵管或子宫拉出切口外,按上述方法进行输卵管移植或子宫移植,如两侧均无黄体者就淘汰。移胚结束后,慢慢取出各种器械,从排气孔放出腹腔内气体,最后拔出套管针外壳。整个过程要注意严格消毒、预防感染,必要时可缝合切口。

目前,绵羊和山羊的采胚和移胚基本上使用手术方法。借助腹腔镜可以进行采胚和移胚,虽然目前成功率稍低于手术方法,但可以通过改进器械或操作方法提高成功率,更重要的是可以避免反复手术可能造成的损伤。

(2)非手术法胚胎移植

羊的非手术移植妊娠率低,还未能在生产实践中应用,有待进一步研究。

9.供、受体的护理与观察

供、受体处理后不仅要注意它们的健康状况,同时要留心观察它们在预定的时间是否发情。受体若表现发情,也不要急于输精,因为有个别受体妊娠后也有发情表现,应做阴道和直肠检查确定是移植失败真发情时才能输精。如果未见发情则需进一步观察和检查,如果确定妊娠,则需要加强饲养管理和保胎防流产工作,并按预产期做好接产和仔畜护理工作。对供体,在下次发情时即可配种,如计划重复做供体,需经2个月左右的恢复时间。

【评估考核】

一、名词解释

1.胚胎移植

2.诱导排卵

3.同期排卵

二、填空

1.胚胎移植的理想时间应在妊娠识别发生之前,通常是在供体发情配种后 d采集胚胎,受体也在相同时间接受胚胎移植。

2.胚胎移植的技术程序包括:_______、_______、_______、_______、_______、_______和胚胎的移植等。

3.受体母羊的选择,其发情时间与供体应相同或相近,一般两者发情时间差不宜超过 _______h。

4.羊的手术法胚胎采集主要包括_______和_______两种方法。

5.胚胎移植操作有_______法和_______法两种。

三、简答

1.简述羊胚胎移植技术应用的意义。

2.简述胚胎移植操作方法。

任务五　羊的其他繁殖新技术

【基本概念】

诱导双羔技术是通过遗传选择、生殖激素、胚胎移植及营养调控等途径,人为地使成年母羊排双卵、产双羔的技术。

性别控制是指通过人为地干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。

体外受精就是将体内、外获得的卵母细胞,在体外(实验室)进行精卵结合的过程。

同期分娩也称人工引产,是指在母羊妊娠末期的一定时间内,人为使母羊终止妊娠,使其在比较确定的时间内分娩,产出正常的羔羊。

克隆是指不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传物质的动物后代的过程。

【教学重点】

羊的诱导双羔技术、同期分娩技术的主要操作方法和程序。

【教学目标】

1.知识目标

◆了解诱导双羔技术、体外受精技术、性别控制技术、同期分娩技术、克隆技术、胚胎干细胞技术、转基因技术等羊的繁殖新技术基本理论知识。

◆掌握羊的诱导双羔技术、同期分娩技术的主要操作方法和程序。

2.技能目标

◆根据羊的生产需要,掌握促使成年母羊排双卵、产双羔、进行同期分娩的调控技术,提高羊的繁殖率。

【教学内容】

一、诱导双羔技术

(一)概念

通过遗传选择、生殖激素、胚胎移植及营养调控等途径,人为地使成年母羊排双卵、产双羔的技术,称为诱导双羔。

(二)意义

羊是单胎动物且繁殖周期长,但羊的双胎率比较高,其双胎潜力还相当大。应用一胎双羔技术可提高双羔率,可成倍提高羊的繁殖力,增加后代数量;诱导双羔可相对减少基础母羊饲养只数,节省饲养管理费用,降低生产成本。

(三)方法

1.复合促性腺激素诱导双羔

用于诱导双羔的促性腺激素主要是FSH和PMSG。随着生殖激素研究的进展,PMSG、FSH等制成的复合促性腺激素使用效果比较稳定。用促性腺激素诱导双羔,使用简便,提高双羔率效果显著。但诱导双羔也存在一些问题,一是成本高;二是作用时间短,只在一个发情期起作用。

2.生殖激素免疫诱导双羔方法

(1)甾体(类固醇)激素免疫诱导双羔方法

从20世纪70年代初开始,澳大利亚CSIRO和Glaxo公司共同花了10年时间研制出一种提高母羊排卵率的类固醇蛋白质制剂称为双羔素或双胎素。用性腺激素免疫的方法,调节机体生殖内分泌系统的生殖功能,使母羊多排卵、多产羔。

(2)抑制素免疫诱导双羔的方法及效果

从母羊卵泡液和公羊精液中提取抑制素主动免疫母羊,卵泡发育率、排卵率均有提高,诱发了双羔。

3.胚胎移植诱导双羔的方法

(1)人工授精+胚胎移植法(AI+ET法)

该法即追加1枚胚胎到已输精母羊体内,这种方法使用较多。

(2)移植两枚整胚

将两枚胚胎移植到受体母羊体内,提高移植妊娠率和双胎率。

(3)移植两枚半胚

近年来,随着胚胎工程技术的进展,采用胚胎分割技术,产同卵双羔成为可能。直接分割新鲜胚胎(一分为二),裸半胚直接移植给受体。

4.营养调控诱导双羔方法

营养对绵羊的繁殖力影响很大,尤其是配种前的营养对繁殖力影响更大,配种前体重与双羔率有密切关系,膘情和体质好的母羊,总受胎率、双羔率都比较高。

二、体外受精技术

(一)概念

体外受精就是将体内、外获得的卵母细胞,在体外(实验室)进行精卵结合的过程。由卵母细胞体外成熟、体外受精、受精卵体外培养3个关键环节构成。通过体外受精获得的后代又称为“试管动物”。

(二)意义

①克服母羊不孕,提高繁殖效率。可使由于输卵管堵塞或排卵障碍等原因不能受孕的母畜正常繁殖后代。

②扩大胚胎来源。可以利用屠宰母羊的卵巢采集卵母细胞,或者结合活体采卵技术从良种羊体内采集卵母细胞进行体外受精,从而可“工厂化”生产胚胎,为胚胎移植提供充足而廉价的胚胎。

③使羔羊提早在幼龄时繁殖后代,缩短世代间隔,加快育种进程。

④为其他动物繁殖生物技术,如克隆、转基因、性别控制等提供丰富的实验材料和必要的实验手段。

(三)方法

体外受精技术包括以下5个环节。

1.卵母细胞的获得

卵母细胞可从屠宰母羊的卵巢中获得,也可用活体采卵法直接从活羊卵巢上获得。

2.卵母细胞的体外成熟

将获得的未成熟卵母细胞在培养系统中进行培养使其成熟。

3.精子与卵子的体外受精

将获得精子与成熟卵母细胞放在一起进行精卵共同孵育,使其形成受精卵。

4.早期胚胎培养

在一定的温度、气象条件下,将受精卵在体外培养液中培养,使其发育至桑葚胚或囊胚。

5.胚胎移植或冷冻保存

体外培养至桑葚胚或囊胚进行移植或冷冻保存后再移植。

三、性别控制技术

(一)概念

性别控制是指通过人为地干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。它主要有两种途径:一是卵子在受精之前,即对精子进行分离,使之在受精之时便决定性别。二是在受精之后,即对受精后的早期胚胎进行性别鉴定,从而获得所需性别的后代。

(二)意义

①可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度),获得最大经济效益。

②可利用性别控制技术以更高的效率繁殖出所需性别的种羊。

③可提高育种效率。对后裔测定来说,性别控制比无性别控制至少可以节省一半的时间和费用。

(三)方法

1.X和Y精子分离方法

X和Y精子分离方法主要有物理学分离法、免疫学分离法和流式细胞仪分离法3种。因前两种方法都缺乏可靠性和可重复性,目前,流式细胞仪分离法才是最科学、最可靠、准确性较高的分离精子的方法。其具体为:将预分离精液稀释,与荧光染料Hoechst33342共同培养,这时染料定量与DNA结合。由于X精子比Y精子含有较多的DNA,所以X精子放射出较强的荧光信号。放射出的信号通过仪器和计算机系统扩增,分析并分辨出X和Y精子。当含有精子的缓冲液离开激光系统时,借助于颤动的流动室将垂直流下的液柱变成微小的液滴,含有单个精子的液滴被充上正电荷或负电荷,并借助两块各自带正电和负电的偏斜板,把X和Y精子分别引导到两个收集管中。

2.早期胚胎性别鉴定方法

早期胚胎性别鉴定方法主要有性染色质鉴定法、染色体组型鉴定法、雄性特异抗原鉴定法和分子生物学方法4种,在生产实践中应用的主要是分子生物学方法。分子生物学方法鉴定早期胚胎性别,又分为雄性特异DNA探针法、PCR聚合酶链式反应检测法和LAMP环介导等温扩增法3种。

四、同期分娩技术

(一)概念

同期分娩也称人工引产,是指在母羊妊娠末期的一定时间内,人为使母羊终止妊娠,使其在比较确定的时间内分娩,产出正常的羔羊。针对于个体称为诱发分娩,针对于群体则称为同期分娩。

(二)意义

①可将妊娠母羊分娩时间控制在相对集中的时间内,便于进行必要的分娩监护和开展有准备的护理工作,可减少或避免新生羔羊和妊娠母羊在分娩期间的伤亡事故。

②可为母羊集中产羔和羔羊同时断奶、同期育肥、集中出栏的全进全出工厂化生产管理提供技术保障,也便于分娩母羊之间新生羔羊的调换。

③对患妊娠后期疾病(如产前产后瘫痪、妊娠毒血症、妊娠周期性阴道脱出和肛门脱出、产前不食综合征等)的危重病例或预期可能发生分娩并发症者(如怀双胎、胎儿过大等),可通过采用诱发分娩再配合其他辅助治疗措施,避免母子双亡的损失等。

④对产羔皮的羊,如湖羊和中卫山羊,对其进行诱发分娩,可提高羔皮的质量。

(三)方法

羊同期分娩通常可以采用单独使用糖皮质激素或前列腺素的方法,也可配合使用雌激素与催产素进行羊的同期分娩。

在羊妊娠期的最后1周内,用糖皮质激素诱发分娩。在羊妊娠的144d时,每只羊注射12～16mg地塞米松或倍他米松,或2mg氟美松可使多数母羊在40～60h内产羔。

对妊娠141～144d的母羊,肌肉注射PGF2a15mg或氯前列烯醇0.1～0.2mg,也可有效地诱发母羊在处理后3～5d产羔。Romano等(2001)对妊娠145d的努比亚奶羊注射PGF2a,结果母羊于注射后31～33h产羔,于产后1.5～2.3h排出胎衣,所产羔羊全部成活。

五、克隆技术

(一)概念

“克隆”一词来源于希腊语,原意为插枝,即无性繁殖的意思。动物克隆是指不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传物质的动物后代的过程。通常,将所有非受精方式繁殖所获得的动物均称为克隆动物。将产生克隆动物的方法称为克隆技术。广义上讲,克隆包括孤雌激活生殖、卵裂球分离与培养、胚胎分割以及核移植。核移植是生产克隆动物最为有效的技术。

(二)意义

①能使遗传性状优秀的个体大量增殖,大大加快羊育种进程。

②可扩大转基因动物的后代数量,提高转基因动物的效率。

③通过性别鉴定再克隆,可生产大量预知性别的动物后代。

④可用于珍稀和濒危动物的扩繁和保护。

⑤可满足动物实验和生物医学研究的特殊需要,提高实验的准确性。

以克隆技术为基础,可研究动物个体发生的核质互作关系、细胞核的分化和重编程、细胞的老化等基础问题。

(三)方法

1.胚胎分割

胚胎分割是通过对胚胎进行显微操作,人工制造同卵双生或多生的技术。胚胎分割又分为显微操作仪分割和徒手分割两种方法。

显微操作仪分割是将待分割胚胎用吸管固定,调节操作仪旋钮,将分割针(刀)调至胚胎正上方,再调节操作仪旋钮垂直将胚胎从中央切开,一分为二,然后将无透明带的两枚裸半胚进行移植或冷冻保存,也可将裸半胚装入空透明带内再移植或冷冻保存。

徒手分割是用链霉蛋白酶软化待分割胚胎,在实体显微镜下,直接用自制分割针(刀)将胚胎一分为二。裸半胚移植和冷冻保存同显微操作仪分割。

2.细胞核移植方法

细胞核移植分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植两种方法,具体程序如下:

(1)核供体准备

将胚胎或体细胞制成单个胚胎细胞(卵裂球)或单个体细胞。

(2)核受体—卵母细胞的去核

将具有完整第一极体的卵母细胞的染色体连同周围胞质一起去除。

(3)注核

将单个胚细胞或体细胞注入去核的胞质质膜与透明带夹角处。

(4)卵母细胞胞质与注入核的融合

将二者在一定融合条件下进行融合,而后培养。

(5)核移植后卵母细胞的激活

将融合后的胚胎在一定条件下激活并培养。

(6)核移植胚胎培养

核移植胚胎在一定条件下进行培养,使其发育成早期胚胎,进行移植或冷冻保存。

六、胚胎干细胞技术

(一)概念

胚胎干细胞又称为ES细胞或EK细胞,是一种从早期胚胎内细胞团或胎儿原始生殖细胞经分离、体外培养、克隆等得到的具有全能性的细胞。

(二)意义

胚胎干细胞在畜牧业、基础生物学和医学上具有重要价值。

①胚胎干细胞可用于转基因动物的生产。

②胚胎干细胞可用于研究哺乳动物个体的发生与发育规律。

③胚胎干细胞可用于体外研究细胞的分化规律。

④胚胎干细胞可用于研究基因的功能。

⑤胚胎干细胞可用于治疗人类的某些疫病。

(三)方法

胚胎于细胞分离培养方法的主要环节有:

1.选择抑制细胞分化的培养体系

培养体系要求不仅能促进胚胎细胞生长,还能抑制细胞分化。目前主要采用滋养层培养体系和条件培养体系以及培养液中添加分化抑制因子3种体系。

2.早期胚胎的选择

一般选择早期囊胚或囊胚阶段的胚胎,也可选择原始生殖细胞。

3.早期胚胎的分离、培养和传代

分离ES细胞的第一步是获得内细胞团(ICM),然后把ICM分散成单个细胞,再放入分化抑制剂培养体系中继续培养,当出现形态均一的未分化克隆细胞时,再把它分散成单个细胞或小细胞团,移入新的培养液中传代培养。

4.ES细胞的鉴定及保持

通过分离培养获得的ICM或PGCS细胞传至8～12代时,通过形态分化和细胞生物学等指标的鉴定,才能确认为ES细胞系,分离得到ES细胞以后,为克服长期培养对遗传物质的有害影响,采用常规保存或冷冻保存两种方法,以维持ES细胞的未分化状态。

七、转基因技术

(一)概念

转基因技术是通过人为方法导入外源DNA或敲除受体基因组中的一段DNA,使羊的基因型和表型发生变化,并且这种变化能遗传给后代的一项生物技术。通过这种方法获得的羊称为转基因羊。

(二)意义

①转基因技术可把生长激素、生长因子、病毒衣壳蛋白基因等导入母羊基因组中,加速生长速度、提高饲料报酬、增强对疾病的抵抗力。

②用羊血液或乳腺作为生物反应器,来生产药用或其他珍贵蛋白质。

③借助转基因动物模型,人们有可能将分子、细胞、组织、器官及个体的发生、发育和衰老统一起来,研究基因的表达调控规律。

④转基因技术可用来制备动物疾病模型,研究人类遗传病的发生、发展规律,制定最佳治疗方案。

(三)方法

转基因技术的操作主要有以下环节。

1.表达载体的构建

通过表达载体的结构、调控序列的选择、目标基因的分离、表达载体的组装、表达载体的扩增等完成表达载体的构建。

2.基因转移

将已构建好的、携带外源基因的基因载体系统通过原核注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体法、生殖细胞感染法、细胞核移植法等任意一种方法导入早期胚胎的基因组中。

3.胚胎移植

将上述得到的转基因的胚胎移植到代孕母体,妊娠足月后产下转基因动物。

4.转基因动物的检测

获得的转基因动物,从DNA整合、RNA转录、蛋白质表达3个水平上对目的基因的转移是否成功进行检测。

【评估考核】

一、名词解释

1.诱导双羔技术

2.性别控制技术

3.同期分娩技术

4.克隆技术

5.转基因技术

二、填空

1.用于诱导双羔的促性腺激素主要是_______和_______两种。

2.体外受精技术主要包括_______、_______、_______、_______、_______5个环节。

3.羊同期分娩通常可以采用单独使用_______激素或_______的方法,也可配 合使用_______与_______进行羊的同期分娩。

三、简答

1.简述羊诱导双羔技术应用的意义。

2.简述羊同期分娩技术的操作方法。