肾上腺素自氧化法

13．3．3　肾上腺素自氧化法

13．3．3．1　原理

在酸性溶液中肾上腺素很稳定，但是当pH超过8．5以后其自氧化速率随pH的增加而加强，其自氧化产物为肾上腺素红，在480nm处有光吸收峰。肾上腺素自氧化过程与连苯三酚相似，能产生自由基，且在一定范围内肾上腺素自氧化的速率与的浓度相关。在SOD存在的条件下，发生歧化反应生成H₂O₂及O₂，从而使浓度降低，肾上腺素自氧化速率减慢，可通过480nm处比色计算出样品中SOD活性。

13．3．3．2　试剂

（1）0．5mol/L碳酸钠缓冲液（pH为10．2），含1×10⁴mol/L EDTA。

（2）10mmol/L HCl。

（3）3×10－3　mol/L肾上腺素：用10mmol/L的HCl配制。

13．3．3．3　实验步骤

（1）调整肾上腺素自氧化速率，按表13－7加样。

表13－7　肾上腺素自氧化速率的加样表

具体操作如下：试管加入缓冲液，限30℃，保温10min，加入30℃预热的肾上腺素，迅速摇匀，倒入1cm比色杯中，开始计时。2min以后，在480nm下每隔1min测光吸收值一次，自氧化速率测定在加入肾上腺素后第2至第4min内有效。要求自氧化速率为0．25/min。

（2）肾上腺素最大抑制率的测定。将表13－7中的双蒸水换成等体积的不同浓度的SOD样液，测定步骤同（1）中的描述，在480nm下，每隔1min测第2～4min之间的吸光度值一次，计算平均每1min吸光度变化值ΔA480/min。调整SOD样品液的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定体系后，肾上腺素自氧化速率达最大抑制值的50%左右。

（3）酶活性计算。SOD活性单位定义：在规定条件下，1mL反应液中，每min抑制肾上腺素自氧化速率（480nm吸光度值）达最大抑制率的50%的酶量为1个酶活性单位（u）。样品液中每mL样品体积或每mg蛋白质的总SOD活性单位数称为样品液的SOD比活性（u/mL）或（u/mg蛋白）。按下式计算

样品SOD比活（u/mg蛋白）＝单位体积活性（u/mL）/c_Pr式中，V_总——反应总体积3（mL）；V_样——加入样品液的体积0．1（mL）；V_定义——酶活性单位定义体积1（mL）；c_Pr——样品液蛋白质含量（mg/mL）。

13．3．3．4　注意事项

（1）在此规定实验条件下，1u的SOD约相当于46ng。

（2）该法灵敏度不高，但测定手续简单，灵敏度可以设法增加，改用310nm波长可使灵敏度提高4倍。

（3）在pH为8．5以下，SOD无抑制反应的能力。

（4）肾上腺素自氧化过程中产生的机制复杂，在实际应用中须考虑干扰因素。