普通光学显微镜的使用及细菌形态的观察

普通光学显微镜的使用及细菌形态的观察_现代微生物学实验

实验一　普通光学显微镜的使用及细菌形态的观察

一、实验目的

（1）了解普通光学显微镜的构造、基本原理、维护及保养方法。

（2）学习并掌握普通光学显微镜的正确使用方法。

（3）掌握使用油镜观察细菌形态的基本技术。

二、实验原理

（一）显微镜的基本构造

普通光学显微镜是利用目镜和物镜两组透镜系统来放大物像的。由机械部分和光学部分组成。（见图1－1）。

图1－1　光学显微镜构造示意

（1）光学部分：接目镜（目镜）、接物镜（物镜）、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜、光源等）。

（2）机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、物镜转移器、调焦装置（粗调节器和细调节器）等部件。

（二）油镜的工作原理

（1）增加照明强度

油镜与其他物镜的不同之处在于载玻片与接物镜之间的介质不是空气，而是与玻璃折射率（n＝1．55）相仿的镜油（通常选用香柏油，其折射率n＝1．52）。当光线通过载玻片后，可以直接通过香柏油进入物镜，几乎不发生折射（图1－2），增加了视野的进光量，从而使物像更加清晰。

图1－2　干燥系物镜与油浸系物镜光线通路

（2）增加显微镜的分辨率

显微镜的放大倍数＝接物镜放大倍数×接目镜放大倍数显微镜的分辨率：表示显微镜辨析两点之间距离的能力。可用公式表示为：

式中：D为物镜分辨出物体两点间的最短距离。D值越小，分辨率越高，看到的物像越清晰；

λ为可见光的波长（0．4～0．77μm，平均0．555μm）；

n为物镜和被检标本间介质的折射率；

α为镜口角（即光线入射角，最大为120°）；

θ为镜口角口的半数（图1－3）。

NA＝sinθ为物镜的数值孔径值。

图1－3　物镜的光线入射角

由于香柏油的折射率（1．52）比空气和水的折射率（分别为1．0和1．33）高，因此以香柏油作为镜头和玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值要高于低倍镜、高倍镜等干镜。若以可见光的平均波长0．55μm来计算，数值孔径通常在0．65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0．4μm的物体，而油镜的分辨率可达到0．2μm。

三、实验器材

（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乳杆菌（Lactobacillus）、变形杆菌（proteus bacillus vulgaris）等细菌染色片。

（2）溶液或试剂：香柏油、乙醇－乙醚（3∶7，V／V）混合液。

（3）仪器或其他用具：普通光学显微镜、擦镜纸。

四、实验步骤

普通光学显微镜的使用流程：

取镜→安置→调光源→调目镜→调聚光器→镜检（低倍镜→高倍镜→油镜）→清洁物镜镜头→复原。

（一）观察前的准备

（1）显微镜的安置。拿显微镜时，应一手握镜臂，一手托镜座，置于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3～4cm，使用前先熟悉显微镜的结构和性能，检查各部分零件是否齐全，镜身有无尘土，镜头是否洁净。镜检时姿势要端正。

（2）调节光源。安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的亮度为止。

（3）调节双筒显微镜的目镜。双筒显微镜的目镜间距可以根据使用者的个人情况适当调节。

（4）聚光器数值孔径值的调节。调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。

（二）显微观察

物镜的使用——先低倍、后高倍、再油镜。

调焦的规律——由上而下。勿使物镜镜头碰触玻片，以免损坏物镜。

（1）低倍镜观察。将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接近标本，先用粗调节器（粗调螺旋）将载物台升至最高，再缓慢下降直至出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。

（2）高倍镜观察。在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，对聚光器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。

（3）油镜观察。在高倍镜下找到合适的观察目标将其移至视野中心，将高倍镜转离工作位置，在待观察的样品区域滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中。将聚光器升至最高位置并开足光圈，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。

使用油镜观察染色标本时，光线宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，光线调至最强。

注意：不可将高倍镜转动经过滴有镜油的区域。

（三）显微镜用毕后的处理

（1）上升镜筒，取下载片。

（2）用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许乙醇－乙醚（V／V＝7∶3）混合溶液擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的清洗液。

（3）用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。

（4）将各部分还原，将光源灯亮度调至最低后关闭，将最低放大倍数的物镜转到工作位置，同时将载物台降低到最低位置，并降下聚光灯。

（四）显微镜保养和使用中的注意事项

（1）不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。

（2）目镜和物镜镜面只能用擦镜纸擦，而不能用手指或粗布去擦，以保证光洁度。

（3）观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。若已使用过油镜，则不要再用高倍镜，以免镜油污染镜头难以清洁。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片损伤镜面。

（4）拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。

（5）显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

五、实验记录

图示所观察的细菌，标明菌名（中文及拉丁文名称）、放大倍数、菌体形状、颜色、有无芽孢、排列方式等。

结果记录：

六、思考题

（1）用油镜观察时应该注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？

（2）什么是物镜同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？

（3）影响显微镜分辨率的因素有哪些？

课后阅读

一、荧光显微镜

荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光。荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

图1－4　荧光显微镜

图1－5　溶藻弧菌荧光显微镜图

荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：

（1）照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上。

（2）光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。

（3）有两个特殊的滤光片，光源前的用于滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，以保护人眼。

荧光显微镜也是光学显微镜的一种，两者的主要区别是激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。

荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。

使用荧光显微镜的注意事项：

（1）在用透射式荧光显微镜时，若使用暗视野聚光器，应特别注意光轴中心的调整。

（2）荧光镜检应在暗室观察。

（3）高压汞灯启动后需等15min左右才能达到稳定，亮度达到最大时方可使用。高压汞灯不要频繁开启，若开启次数多、时间短，会使汞灯寿命大大缩短。

（4）在观察与镜检合适物像时，宜先用普通明视野观察，当准确检查到物像时，再换荧光镜检，这样可减轻荧光消褪现象。

（5）观察与摄影应尽量争取在短时间内完成，可采用感光度较高的底片摄影。

（6）紫外线易伤害人的眼睛，必须避免直视激发光。

（7）光源附近不可放置易燃品。

（8）镜检完毕，应将显微镜做好清洁工作后，方可离开工作室。

二、倒置显微镜

倒置显微镜其组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，主要用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。

倒置显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。倒置显微镜比放大镜具有更高的放大率。

物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像，再经目镜放大为虚像后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样，所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。

图1－6　倒置显微镜

图1－7　多维活细胞倒置显微镜图^[1]

三、电子显微镜

1932年，Ruska E及其同事以波长比可见光短得多的电子束作为光源，使电磁透镜的分辨能力高达0．1nm，放大倍数可高达100万倍。

人的眼睛只能分辨1／10毫米以上的物体。随着电镜技术的迅猛发展，继透射电镜之后，又相继研制出扫描电子显微镜、扫描透射电镜和具有分析功能的分析电镜等新型电镜。有了各种类型的电子显微镜，人们不仅可以清晰地观察微生物的细胞器、病毒的细微结构，还能观察到生物大分子物质，并能对生物进行综合性的功能研究。现在，电子显微镜及其显微技术已经成为现代生物科学研究不可缺少的工具和手段。

图1－8　电子显微镜

（1）透射电子显微镜

透射电子显微镜的结构主要包括：电子枪、电磁聚光器、电磁物镜、投影物镜、观察目镜、荧光屏或影像板等。

透射电子显微镜以高速的电子束代替光学显微镜的光束，通过电磁透镜使被检物放大成像。在高真空的电子枪内，在加速电压为100kV时，电子波波长为0．003 7nm，其分辨力可达0．1nm，比光学显微镜的分辨率提高2 000倍。

透射电子显微镜物像的形成，主要是基于电子的散射作用和干涉作用。由电子的散射作用造成的反差以强度的变化显示出来，称为“振幅反差”。在用电子显微镜进行低倍观察时，振幅反差是主要的反差源。人眼不可见的电子束通过电磁透镜放大了被检测物的物像，最终在电子显微镜的荧光屏上呈现。

（2）扫描电子显微镜

扫描电子显微镜的结构主要包括电子枪、电磁镜、电子探测器、放大器、观察荧光屏等。

扫描电子显微镜主要被用于观察被检物样品的表面立体结构，进行表面形貌观察研究，还能得到关于样品的其他信息，其图像清晰逼真。扫描电镜的分辨力小于6nm，其总放大倍数从20～100 000倍连续可调。

图1－9　超高压处理后副溶血弧菌的透射电镜图

（上：超高压处理之前；下：超高压处理之后）

图1－10　超高压处理后副溶血弧菌的扫描电镜图^[2]

扫描电子显微镜的工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜的不同。其成像是由电子枪发出的电子束，被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束扫到之处样品表面因被激发而放出二次电子并产生许多物理信号。二次电子由探测器收集，并被闪烁器转变成光信号，再经光电倍增管和放大器又变成电压信号，控制荧光屏上电子束的强度。二次电子产生的多少与样品表面的立体形貌有关，样品上产生二次电子多的地方，在荧光屏上相应的部位就越亮，反之则越暗，最终会得到一幅放大的样品立体图像。由于扫描电镜电子束孔径角极小，故景深比透射电镜大，成像具有很强的立体感。

参考文献

［1］沈萍，陈向东．微生物学实验［M］．4版．北京：高等教育出版社，2007．

［2］赵斌，何绍江．微生物学实验［M］．北京：科学出版社，2002．

［3］杨汝德．现代工业微生物学实验技术［M］．北京：科学出版社，2009．

【注释】

[1]引自百度图库http：／／image．baidu．com／i？ct＝503316480＆z＝＆tn＝baiduimagedetail＆ipn＝d＆word＝多维活细胞倒置显微镜图。

[2]引自Wang Chung Yi．Inactivation and morphological damage of Vibrio parahaemolyticus treated with high hydrostatic pressure，Food Control，2013（32）：348—353。