细菌的基本形态和特殊结构观察

实验五　细菌的基本形态和特殊结构观察

一、目的要求

1．掌握显微镜油镜的使用和保护，熟悉显微镜的结构及各部分的构造。

2．熟悉细菌不染色检查法及不染色检查法的临床意义。

3．掌握细菌的基本形态及镜下观察。

4．掌握细菌特殊形态的观察。

二、实验原理

细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌3大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌的特殊结构包括荚膜、芽胞、鞭毛等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等影响发生变化。细菌个体微小，较透明，未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

在标准光学筒长一定的情况下，显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。放大倍数指的是长度而不是面积。

显微镜的优劣主要决定于分辨率（Resolution or Resolving Power）的大小。分辨率是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，由照明光线的波长（λ）和物镜的镜口率（数值孔径）决定。分辨率公式如下。

λ＝光波波长；NA＝物镜的数值孔径值（Numerical Aperture）。

一般光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0．4～0．7μm），而数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为NA＝n·sinα。其中α为光线最大入射角的半数，取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120°，而n为介质折射率。

油镜的放大倍数可达100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从载玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头如图1－9所示，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。若在油镜与载玻片中间加入和玻片折射率（n＝1．52）相近的香柏油（n＝1．515），则使通过的光线不致产生折射而损失，进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，因此能清楚地看到物像。

由于香柏油的折射率（1．515）比空气及水的折射率（分别为1．0和1．33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1．2～1．4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1．0）。若以可见光的平均波长0．55μm来计算，数值孔径通常在0．65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0．4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0．2μm左右。

图1－9　油镜的工作原理

三、实验内容及方法

（一）油镜的使用

1．材料。

显微镜、待检细菌涂片标本。

2．方法。

（1）显微镜的放置。将显微镜放于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3～4cm。镜检时姿势要端正。

（2）光源调节。安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。

（3）目镜间距调节。根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜间距，左目镜上一般配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

（4）光圈调节。调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值、孔径值相符或略低，以控制入射光线的量，增加明暗差，然后通过升降聚光器或改变光源的亮度，获得亮度适宜的视野。

（5）低倍镜观察。将待观察的标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。边转动粗调螺旋边从侧面观察，使物镜降至距标本约0．5cm；从目镜观察，调节聚光器使光强适中。然后边观察边用粗调螺旋慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图像清晰。通过玻片推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物。

（6）转换成油镜。提高镜筒，在标本欲检处滴加香柏油一滴，然后转换成油镜。显微镜油镜头上常有下列几种标记：放大倍数是100×、镜头下缘常有一黑圈、透镜直径最小、刻有“油”或外文“oil”字样。将集光器上升到最高位置，与载物台孔平行，并将光圈开至最大。（当用低倍镜或高倍镜检查时，应缩小光圈，下降集光器，使光度减弱。）

（7）油镜镜检。眼睛从镜筒侧面观察，并顺时针方向扭动粗调螺旋，使镜筒徐徐下降，让油镜头浸入油内，当油镜头几乎接近标本表面时停止转动，然后将眼睛移至目镜，边观察边向上（逆时针方向）徐徐扭动粗调螺旋，至视野中看到模糊物像时，再换用微调螺旋调至物像清晰为止。调节时千万不可使用强力将物镜任意下降，以免压碎标本片，甚至将贵重的油镜头损坏。

（8）观察并记录。找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

（9）擦镜头。观察完毕，向上扭动粗调螺旋，将镜筒提起，取下标本片，立即用擦镜纸将油镜头上多余的油擦干净。再用另一张擦镜纸蘸取二甲苯（或乙醚酒精）擦去残存的油迹，最后用一张干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。擦时应顺一个方向擦，不能绕圈，这样会越擦越模糊。

（10）送回显微镜。将聚光器转至四倍接物镜，集光器下降，然后转动粗调螺旋，使镜筒下移，以避免接物镜与集光器相碰受损，拔下电源，送回显微镜室。

（二）细菌基本形态和特殊结构的观察

1．材料。

细菌基本形态示教片：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、炭疽杆菌、霍乱弧菌、钩端螺旋体。

细菌特殊结构示教片：破伤风梭菌（示芽胞）、肺炎链球菌（示荚膜）、变形杆菌（示鞭毛）。

其他：显微镜、擦镜纸、二甲苯等。

2．方法。

（1）用油镜观察细菌基本形态，注意各菌的形状、大小、排列方式等特点。

（2）观察特殊结构示教片，注意芽胞在菌体上的位置和大小、荚膜的大小及其与菌体的关系、鞭毛的形态数量及着生位置，记录结果。

3．结果记录及分析。

观察并绘图，要求：细菌的大小要合理；标示出细菌名称、放大倍数、染色方法等，并用文字内容略加描述。

绘图示例：

图××葡萄球菌×1000紫色G^＋

（三）不染色标本的制备及观察（悬滴法）

1．材料。

菌株：变形杆菌8～12h肉汤培养物。

其他：凹玻片、盖玻片、凡士林、火柴杆、镊子等。

2．方法。

（1）取洁净凹玻片一张，用火柴杆在凹窝四周涂凡士林少许。

（2）取1～2滴菌液，滴到盖玻片中央（勿使菌液流开）。

（3）将凹玻片倒合于盖玻片上，迅速翻转，使液滴正好对准凹玻片的窝心，然后再轻轻按下，使盖玻片与凡士林紧密固定。

（4）先用低倍镜找到悬滴边缘，再将液滴移至视野中央，然后转换高倍镜观察，背景要稍暗些，下降聚光器，缩小光圈。

（5）记录观察结果。

3．结果记录及分析。

描述观察到的现象，并绘图。

四、思考与讨论

1．在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。

2．使用油镜时油不要滴太多，也不宜太少。在调节焦距的时候要特别注意与载玻片之间的距离。

3．如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得再用40倍镜对准加油区，以免油沾污镜头。

4．不染色标本观察时，视野应尽量调暗，否则不宜观察到。