光学显微镜的使用与细胞形态结构的观察

实验实训二　光学显微镜的使用与细胞形态结构的观察

一、实训目标

（1）了解普通光学显微镜的构造及其功能，初步掌握显微镜的使用方法。

（2）掌握真核细胞的基本结构。

二、实训材料、试剂与仪器

1．材料

洋葱鳞茎与叶片结构永久切片、柿胚乳永久切片、人血涂片、小肠横切片。

2．试剂与仪器

显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸、擦镜纸、纱布块、蒸馏水。

三、操作要点

（一）显微镜的构造与使用

1．显微镜的构造

基本结构包括用于成像的光学系统和用于装置光学系统的机械部分。

（1）机械部分：

①镜座　显微镜基座，用以支持镜体的平衡，装有反光镜或照明光源。

②镜柱　镜座上面直立的短柱，连接、支持镜臂及以上部分。

③镜臂　弯曲如臂，下连镜柱，上连镜筒，是取放显微镜时手握的部位。直筒显微镜镜臂的下端与镜柱连接处有一活动关节，称倾斜关节，可使镜体在一定范围内后倾，便于观察（一般倾斜不超过30°）。

④镜筒　显微镜上部圆形中空的长筒，其上端放置目镜，下端与物镜转换器相连。对于双筒斜式的镜筒，两筒距离可以根据两眼距离及视力来调节。镜筒一般长160mm或170mm。镜筒的作用是保护成像光路与亮度。学生使用的多为单筒镜，示教观察使用的常为双筒镜。

⑤物镜转换器　装在镜筒下端的圆盘，可作圆周转动。盘上有3～5个螺口，在螺口上面可按顺序安装不同倍数的物镜。旋转转换器，物镜即可固定在使用的位置，保证目镜与物镜光线合轴。

⑥载物台（镜台）　放置标本的平台，中央有一圆孔以通过光线。上有标本推进器，用以固定和移动标本（可将标本向前、后、左、右移动）。推进器上装有游标尺，用以计算标本大小或标记被检标本的部位。

⑦调焦装置　为得到清晰的物像，必须调节物镜与标本之间的距离，使它与物镜工作距离相等，这种操作叫调焦。镜臂两侧有粗、细调焦螺旋各一对，旋转时使镜筒上升或下降。大的一对是粗调焦螺旋，每旋转一周，使镜筒升降10mm，用于低倍物镜检查标本时使用；小的是细调焦螺旋，每旋转一周，使镜筒升降0．1mm，用于高倍物镜观察时使用，转动细调不可超过180°。

⑧聚光器调节螺旋　安装在镜柱的左侧或右侧，旋转它时可以使聚光器上下移动，借以调节光线。

（2）光学部分　由成像系统和照明系统组成。成像系统包括物镜和目镜，照明系统包括反光镜或电光源、聚光器。

①物镜　物镜的作用是将标本第一次放大成倒像。一般显微镜有几个放大倍数不同的物镜。例如4×、10×为低倍物镜，40×为高倍物镜，这类物镜与标本之间不需要加任何液体介质进行观察的称为干燥物镜；100×的称为油浸物镜（使用时需在标本和物镜之间加入折射率大于1，而与玻片折射率相近的液体，如香柏油作为介质）。在物镜上刻有“40/0．65160/0．17”类字样。40表示物镜放大倍数，0．65表示数字孔径（NA）即镜口率，镜头倍数不同，镜口率也不同，如10×物镜镜口率为0．25，镜口率愈大则工作距离（指物镜透镜表面与盖玻片表面之间距离）愈小，分辨能力越高。所谓分辨率，是指显微镜能分辨两点之间最小的距离。分辨两点间的距离越小，分辨率越大。160表示镜筒长160 mm，0．17表示要求盖玻片的厚度为0．17mm。

②目镜　安装在镜筒上端，其作用是将物镜放大所成的像进一步放大，便于观察。其上刻有放大倍数（如5×、10×等），可根据观察需要而选择使用。学生用显微镜在目镜内光阑上可用凡士林粘贴安装一段头发，在视野中则成一黑线，叫“指针”，可用它指示所观察部位。根据需要，目镜内也可安装目镜测微尺，用以测量所观察物体的大小。显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数。

③聚光器　装在载物台下方的聚光器架上，由聚光镜（几个凸透镜）和虹彩光圈（可变光阑）组成，它可以使散射光汇集成束、集中一点，以增强被检物体的照明。聚光器可上下调节。当用高倍物镜时，视野范围小，则需上升聚光器；用低倍物镜时，视野范围大，可下降聚光器。虹彩光圈装在聚光器内，拨动操作杆，可使光圈扩大或缩小，借以调节通光量。

④反光镜　装在聚光器或光圈盘下方的镜座插孔中，它可以朝任一方向旋转以对准光源。它有平、凹两面，平面镜能反光；凹面镜兼有反光和聚光作用，一般在光线充足时使用平面镜，光线不足时使用凹面镜。有的显微镜使用电光源。

2．显微镜成像原理

显微镜的成像放大系统由物镜和目镜两组透镜组成。标本经物镜第一次放大在目镜焦点平面上形成倒置的实像，再经目镜第二次放大达到人的眼球，最后所看到的标本，成为一个方向相反倒置的虚像。因此使用显微镜时，标本移动的方向常和人眼所观察的物像相反。这样常使初学使用显微镜的人感到困难，需要经过一段时间的实践，才能操作自如。

3．使用显微镜的方法及步骤

显微镜使用主要包括两个方面：一是光度调节，二是焦距调节。

（1）取镜和放镜　从显微镜柜中按座号取出镜箱（内有显微镜）时，右手握住镜箱手柄，左手托住镜箱底部，以大拇指按住箱门，并靠胸前拿到座位上。用钥匙打开箱门，右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立（特别不允许单手提着镜子走，防止目镜从镜筒中滑出），放置在座位桌子左侧距桌边5～6cm处，以便于观察和防止显微镜掉落。要求桌子平稳，桌面清洁，避免直射阳光。然后用纱布揩拭镜身机械部分的灰尘，用特制擦镜纸擦拭光学部分。

（2）对光　一般用由窗口进入室内的散射光（应避免直射阳光），或用日光灯作光源。对光时，先将低倍物镜转到中央，对准载物台的通光孔，然后用左眼（或双眼）从目镜向下观察，同时用手转动反光镜，使镜面向着光源，当光线从反光镜表面向上反射入镜筒时，在镜筒内就可看到一个圆形、明亮的视野，这时再利用聚光器或虹彩光圈调节光的强度，使视野内光线既均匀、明亮又不刺眼。

（3）低倍物镜的使用　观察任何标本，都必须先用低倍物镜观察，因为低倍物镜视野范围大，易于发现观察目标和确定观察部位。

①放置玻片标本　升高镜筒，把玻片标本放置于标本推进器内，使材料正对通光孔中心。

②调整焦距　两眼从侧面注视物镜，向顺时针方向转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐下降（或载物台徐徐上升）至物镜距玻片5mm处。接着用左眼或双目注视镜筒内，同时按逆时针方向慢慢转动粗调焦螺旋使镜筒慢慢上升，直至看到清晰的物像为止（注意绝不能在观察时下降镜筒，否则会压碎玻片，损坏镜头）。如果一次调焦看不到物像，则应检查玻片是否放反了，或材料是否放在光轴线上，然后重新移正材料，再重复上述过程，直至物像出现和清晰为止。为了使物像更加清晰，此时可稍微转动细调焦螺旋，到物像最清晰为止。

③低倍物镜观察　焦距调好后，根据需要，移动标本移动器向前后左右移动玻片，将观察部分移到最佳位置上，找好物像后，还可根据材料厚薄、颜色、成像反差强弱是否合适等再进行调节，如果视野太亮，可降低聚光器或缩小虹彩光圈，反之则升高聚光器或开大光圈。

（4）高倍物镜观察　在低倍物镜观察基础上，需要观察细微结构或较小的物体，可使用高倍物镜观察。

①选好目标　由于高倍物镜视野范围较小，因此使用高倍物镜前应在低倍物镜下选好欲观察的目标，并移至视野中央，然后转动物镜转换器，换上高倍物镜，并使之合轴，即使其与镜筒成一直线。使用高倍物镜时，由于物镜与标本之间距离很近，因此操作时要特别仔细，以防镜头碰击玻片。

②调整焦点　在正常情况下高倍物镜转动后，在视野中即可见到模糊的物像，只要稍许调节一下细调焦螺旋，就可获得最清晰的物像。

③调节光亮度　在换用高倍物镜时，视野变小变暗，所以要重新调节视野亮度，此时可升高聚光器或放大虹彩光圈。

（5）油镜的使用　在使用油镜之前，也要先用低倍镜找到被检部分，变换成高倍镜调整焦点，并将被检查部分移到视野中央，然后换用油镜。使用油镜时须先在盖玻片上滴加1滴香柏油才能使用。用油镜观察标本时，绝对不能使用粗调焦螺旋，只能使用细调焦螺旋调节焦点。如盖玻片过厚，必须换成薄片方可调焦，否则会压碎玻片而损坏镜头。油镜使用完毕后，应立即用擦镜纸蘸少许清洁剂擦去镜头上的油迹。

（6）调换玻片标本　观察完毕，当需换看另一玻片标本时，转动物镜转换器，将高倍物镜换成低倍物镜，取出玻片，换上新玻片标本，然后重新从低倍物镜开始观察。千万不要在高倍物镜下换片，以免损坏镜头。

（7）显微镜使用后的整理　观察结束，将镜筒升高，取下玻片标本，转动物镜转换器，使物镜头转离通光孔，再下降镜筒到适当高度，并将标本推进器移到适当位置，将反光镜还原与桌面垂直，擦净镜体，最后右手握住镜臂，左手托住镜座收回镜箱中，锁上箱门，按号放回显微镜柜内。

4．保养和使用显微镜应注意的事项

（1）显微镜是精密仪器，使用时一定要严格遵守操作规程。不许随便拆修。

（2）要随时保持显微镜清洁，不用时及时收回镜箱或用塑料罩罩好。如有灰尘，机械部分用纱布块擦拭，光学部分用镜头毛刷拂去或用吹风球吹去灰尘，再用擦镜纸轻擦，或用脱脂棉棒蘸少许酒精乙醚混合液由透镜中心向外进行轻擦，切忌用手指、纱布等擦抹。

（3）观察临时装片，一定要加盖盖玻片，还须将玻片四周溢出水液擦干再进行观察，并且不能使用倾斜关节，以免水、药液流出污染镜体，损坏镜头。不要让显微镜在阳光下曝晒。电光源在不进行观察时应及时关闭。

（4）使用40×物镜观察，视野内往往出现外界景物，此时可慢慢下降聚光器至景物消失，或配合使用凹面反光镜。

（5）观察显微镜时，坐姿要端正，双目张开，切勿紧闭一眼。用左眼观察，右眼作图，应反复训练。

（6）保养显微镜时要求做到防潮、防尘、防热、防剧烈震动，保持镜体清洁、干燥和转动灵活。箱内应放一袋蓝绿色的硅胶干燥剂。不用的镜头应用柔软清洁的纸包好，置于干燥器内保存，梅雨季节要注意检查和擦拭镜头。

（二）动植物细胞基本结构观察

（1）洋葱鳞叶表皮细胞的观察　取洋葱鳞叶，做成临时装片。先进行低倍物镜观察，可见洋葱表皮为一层细胞，注意细胞的形态构造和排列。细胞多为近长方形，形态相似。移动装片，选择几个较清楚的细胞置于视野中央，然后换用高倍镜物镜，观察一个典型的植物细胞的基本结构，识别各部分，着重观察细胞核与液泡。

（2）柿子胚乳细胞的观察　取柿子胚乳细胞切片，先低倍镜观察后转入高倍镜观察。可见到无数多边形的细胞，有明显加厚的细胞壁（初生壁）和较小的细胞腔，其内原生质体往往被染成深色或制片过程中已丢失，使细胞成为空腔。注意观察相邻两细胞加厚壁上有贯穿两细胞的细丝，即胞间连丝，它通过的地方即初生纹孔场。

（3）叶肉细胞的观察　取叶片结构永久切片，注意观察叶肉细胞中的叶绿体。

（4）人血涂片的观察　观察成熟的红细胞以及各类白细胞的形态，并与植物细胞进行比较。

（5）小肠横切片的观察　观察小肠壁内表面单层柱状上皮细胞，该细胞形状细长，似柱状，其卵圆形核靠近基部。

四、问题与讨论

如何计算显微镜的放大倍数？