分子筛法对蛋白质脱盐

实验十一　分子筛法对蛋白质脱盐

【实验目的】

1．掌握分子筛法分离蛋白质和脱盐的基本原理和操作。

2．了解分子筛的应用。

【实验原理】

层析色谱利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。其本质是待分离物质分子在固定相和流动相间分配平衡的过程。

根据两相的状态，层析色谱可以分为气相色谱法、气固色谱法、气液色谱法、液相色谱法、液固色谱法和液液色谱法。按照固定相的几何形式，层析色谱可以分为柱层析色谱法、纸层析色谱法、薄层色谱法。按照色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可以分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法。

吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程，适于分离不同种类的化合物。分配色谱利用固定相与流动相之间对分离组分溶解度的差异来实现分离，本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。其固定相一般为离子交换树脂，分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。尺寸排阻色谱法是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早被洗脱出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内，最后洗脱出色谱柱。样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。尺寸排阻法被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。亲和色谱法是利用样品中不同成分与固定相之间亲和力的不同来分离蛋白质。

分子筛法又叫凝胶层析、尺寸排阻层析、凝胶排阻层析等，被广泛用于混合蛋白质的分离纯化和脱盐。分子筛法用的介质凝胶是一种多孔的网状结构的颗粒。这种凝胶的交联度决定了内部网孔孔径大小。当不同大小的混合样品流经这个多孔凝胶的时候，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶颗粒内部，而沿着凝胶颗粒之间的空隙向下移动;比网孔小的分子就可以进入凝胶，在凝胶颗粒内部反复穿行。由于大分子和小分子穿行凝胶的路径不同，长短距离不同，这些分子流出凝胶的时间就不同。通过收集不同时间的液体，可以将不同大小的分子进行分离。

分子筛法常用的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。使用最多的是交联葡聚糖(Sephadex)。Sephadex是由链状葡聚糖通过交联剂交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也越小;反之越大。以G-x表示型号，从后面的数字可以看出交联度，数字越小，交联度越大，孔径越小。用于脱盐的交联葡聚糖为SephadexG-25，其吸水量为2．5 ml/g，干粒子直径100～300μm，筛孔40～60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子从内水体积流出。

【实验器材】

层析柱1根、乳胶管、止水夹、螺旋夹、滴管1支、烧杯1个、试管15支、黑瓷板1个、紫外分光光度计。

【药品试剂】

1．盐析分离并溶解后的卵球蛋白溶液。

2．双蒸水。

3．水化后的交联葡聚糖凝胶溶液。

4．1%醋酸钡溶液。

5．硫酸铵溶液。

【实验方法】

1．垂直固定层析柱，并安装乳胶管、止水夹和螺旋夹。

2．向层析柱中加入1/3体积的水，以平衡并排出基质和乳胶管中的气泡;注意观察空管中的水流速度，如果慢，表明层析柱下端的砂芯上有杂质附着需要反复用流水冲洗层析柱，直至流速变快。

3．液面降至基质上2 cm后，用螺旋夹调节流速至1～2滴/秒。

4．将合适浓度的凝胶悬液缓慢匀速倒入层析柱中，使凝胶自然沉降，柱高25～30 cm，注意装填均匀，无气泡和裂纹。

5．加入1～1．5倍体积的水以平衡层析柱，充分洗去凝胶中可能残留的蛋白质和盐类，直至液面到凝胶床表面后关闭止水夹。

6．用滴管均匀上样，打开止水夹，并在下端用试管接住流出的液体。

7．待蛋白质样品完全进入层析柱后，加入水继续洗脱蛋白质，注意加水速度恒定，以保持洗脱压强一致。将试管标记顺序，每管收集2 ml洗脱液。

8．从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀。以双蒸水做阴性对照，硫酸铵溶液为阳性对照，对比阴性对照和阳性对照的沉淀情况，用++/+/－记录每管硫酸钡沉淀情况。待盐离子浓度降为零后，停止洗脱。

9．将2 ml分步收集的样品洗脱液加入1 ml H₂O，测定A₂₈₀的吸光度，以洗脱液体积为横坐标，A₂₈₀为纵坐标做蛋白浓度曲线。

【注意事项】

1．凝胶柱装填和使用过程中，应保持凝胶面上始终有水，否则气泡进入将影响实验结果。

2．样品溶液的浓度大一些好，但黏度不宜大，加样体积通常为凝胶柱床体积的1%～10%。

3．实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃。

【思考题】

1．分子筛法的原理和用途。

2．影响分子筛法脱盐效果的因素。

3．如果分子筛法分离的蛋白质曲线出现双峰，可能是什么原因造成的?