酶的结构与功能研究取得突破_关于马福祥的故事

酶的结构与功能研究取得突破_关于马福祥的故事

红曲菌产生的糖化酶退出了应用领域后，由于红曲菌是我国独有的传统的食品发酵用霉菌，故该酶产生的糖化酶被作为研究材料进行了结构与功能的理论研究，取得了许多创新性成果。

图 5-1张树政在实验室测定糖化率

此时正是“文化大革命”的“斗批改”阶段，微生物研究所正着手编制研究所的学科发展规划。1972年7月20日,著名物理学家周培源曾就我国基础科学赶上世界科学发展，曾上书周恩来总理提出建议。23日，周恩来便就此信对国务院科教组和中科院负责人作了重要指示，要求科教组和科学院好好议一下周培源的意见，并要认真实施，指出“不要如浮云一样，过后就忘了”。周恩来的指示，成了当时制订规划的指导原则，给张树政很大的鼓舞。她希望能在微生物酶学的基础研究中，有所突破，因此提出建议，希望开展红曲菌淀粉酶的结构与功能这项基础研究。这个建议被采纳，从1970年代初到1985年的十多年时间内，凭借无锡酶制剂厂足量提供的红曲菌葡萄糖淀粉酶制剂，对该种酶进行了有关结构与功能方面的多项研究。

这些工作首先是酶的提纯和结晶，然后对结晶进行了电子显微镜观察，观察到结晶为棒状，晶体内分子呈有序排列，分子为球状，并量出了分子的大小。经进一步纯化后发现红曲菌的葡萄糖淀粉酶具有多型性，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上多个蛋白带，均有酶活力，但活力高低不同，以E3和E4的酶活力及比活力最高。进一步纯化获得了凝胶电泳均一的酶组分E4，测定了其最适反应条件和各种酶学性质。比较了E3和E4两个活性最高组分的分子量和多种酶学性质，检测了酶的底物特异性及作用动力学、水解限度百分率等。他们从那时开始，已涉及糖生物学，探讨了糖肽结合方式，实验证明该酶蛋白分子上的糖分子是以O糖苷键的方式与蛋白质肽键上的丝氨酸或苏氨酸连结的。他们还证明酶长时间作用于高浓度葡萄糖时，可生成少量麦芽糖及异麦芽糖，即通过糖基转移而合成了寡糖。他们又研究了影响酶活力的各种因子，发现葡萄糖酸δ内酯和麦芽糖醇为强的竞争性抑制剂。又对酶分子进行了化学修饰，试验了9种蛋白质侧链修饰剂对酶活力的影响。还用当时相当先进的手段探讨了其分子构象发生变化的条件，发现这两个酶组分的构象存在差异。为了确证E3和E4存在构象差异，又测定了它们的溶剂微扰差光谱、抑制剂微扰差光谱及CD光谱等。对酶多型性形成的原因作了初步探索，早在1990年代，他们已经测定出分子中有N糖苷键的存在，根据内切酶EndoH和EndoD的底物特异性及作用位点，推断红曲菌葡萄糖淀粉酶E3和E4的构象差异是由于糖基化程度不同所引起的。从此他们对糖基化的研究开始深入，并取得了重要成果。(www.guayunfan.com)这个研究课题大约在1980年代基本告一段落，但最后的有关论文发表于1985年，前后延续了15年。他们一共发表了25篇论文。其中有部分结果曾于1978年在日本京都召开的第五届国际食品科学会议上作过报告，还在1980年和1981年举办于上海的中国和联邦德国蛋白质核酸讨论会以及中美蛋白质学术讨论会上进行过分组或大会报告。

1980年，这项工作曾向中国科学院报奖，我们看到有曹天钦和王应睐对该项工作作出的评语。前者认为：“国内对于多糖、糖蛋白和作用于多糖的酶的研究，比较蛋白质、酶与核酸落后。在今日分子生物学和细胞生物学发展中，是一应急起直追的领域，不然要误大事、吃大亏。因此，微生物所这项工作，除去其理论连续实际，在食品工业上有意义外，在学术上，是国内涉及多糖领域的几乎是唯一的比较有系统的，是有国内先进水平的，在国际上还可以拿得出去的工作。我觉得它值得获成果奖。”而王应睐在肯定作者们对红曲菌葡萄糖淀粉酶所作的系统研究的同时，认为这是从应用研究转入基础研究的可喜成果，但他认为还没有达到获得院级奖励的水平。

1985年，当他们的工作告终时，1980年时的许多补充工作得以完成，于是微生物研究所又将整个工作加以汇总，向5位专家征求意见，其中包括4位大学生物化学教授和一位高级研究员。他们一致认为这项研究工作比较系统，实验可靠，论证正确，研究成果具有国内先进水平或达到国际水平，可以作为理论成果上报，申请奖励。当年，这项成果获得了中国科学院1987年科技进步三等奖。

在申奖书上是这样摘要介绍他们的成果的：

1.分离提纯结晶及物化性质的研究。由于该酶具有多型性，给分离纯化及结晶带来很大困难。采用了多种生化分离新技术终于得到了凝胶电泳均一的E3、E4和E5，对E4的物化性质作了较全面的研究，并对E3、E4进行了比较研究。首次获得了红曲菌葡萄糖淀粉酶的结晶。

2.探讨了酶的多分子型形成的原因，并用亲和层析分离证实三个型的差别主要在于含糖量不同。

3.对该酶结晶进行了电镜观察及电子衍射分析。计算出衍射环的层间距。与物理所合作进行了结晶图像的光学处理，使图像清晰。这些工作在国内为首次报道。

4.酶的化学结构研究。酶法降解的肽图谱表明E3和E4存在一定差别。对其中的共同肽段进行了纯化及性质的测定。用溴化氰降解分离到5个肽段，作了N末端测定β消去反应确定该酶的糖以O糖苷键方式结合于肽链的丝氨酸或苏氨酸上。

5.作用机理的研究，测定了酶的底物特异性，并阐明水解产物5作用机理的研究，测定了酶的底物特异性，并阐明水解产物为β构型。检测了影响酶活力的因子，找出葡萄糖酸占一内酯和麦芽糖醇为酶的竞争性抑制剂。通过对酶的化学修饰，查明色氨酸是酶反应所必需的。发现了两个酶分子型E3和E4中必需色氨酸残基暴露程度可能有差异。

6.酶在溶液中构象研究。通过紫外差光谱的研究，发现E3和E4的温度差光谱不同。竞争性抑制剂和微托剂引起的紫外差光谱E3和E4也有差异。根据这紫外CD光谱计算出E3和E4的α螺旋含量分别为22.8%和15.3%。证实E3较E4分子较为紧密的构象。解释了它们对化学修饰剂NBS的反应性有差异。也与温度差光谱相符合。酶的不同分子型存在构象差异是首次报道。

张树政得以完成这项比较系统而全面的基础性研究工作，一方面是由于酶法生产葡萄糖的急需，另一方面是无锡酶制剂厂渊源不断地提供研究用的材料。而酶制剂厂能够大量生产，主要是因为生产上应用的需要。当年之所以能够在相当困难的经费和设备条件下开展具有国际水平的酶的结构与功能研究，还有一段值得特别叙述的故事。