嗜极酶的研究_关于马福祥的故事

嗜极酶的研究_关于马福祥的故事

嗜极菌的酶称为极端酶。1980年代后期，张树政在从事糖苷酶研究的同时，开始关注极端环境下微生物产生的酶，此时对耐高温淀粉酶的需求呼声越来越强，她在自己领导的研究组中开始安排人手从嗜极菌中分离耐高温淀粉酶和其他酶的研究。他们从我国南方的高温温泉中分离了大约250株嗜热细菌，获得了一株芽孢杆菌属细菌，它产生麦芽寡糖的细胞外淀粉酶，其酶解产物中没有葡萄糖。该细菌最适生长温度为65℃，产生的这种酶的最适反应温度为80℃。经过提纯后，测定了它的若干物理化学性质和底物特异性，如果以可溶性淀粉为底物之比活性为100%，则对支链淀粉的比活性为96.5%，对直链淀粉的比活性为，对肝糖和茁霉多糖则只分别有29.6%和23%。该酶在0.1M pH 5.8的醋酸缓冲液中于90℃保温60分钟仍保留了60%的活性。同时，日本学者赠送的一株嗜热栖热菌，其适宜生长温度为65℃，它的细胞内含有一种α葡萄糖苷酶，将这种酶纯化后，发现其离体酶作用的最适温度为80℃，pH为5.8，在0.1M pH 5.8的醋酸缓冲液中于90℃保温10小时仍保留了97%的活性。

他们又从土壤中分离到一株诺卡氏菌，其产生的耐热茁霉多糖酶最适作用温度为55℃，可水解茁霉多糖、直链淀粉和可溶性淀粉，但水解直链淀粉和糖原的活性很弱。又测定了它们的多项酶学性质和酶蛋白的一级结构。

1990年，张树政研究组发表了在诺卡氏菌属放线菌中发现了耐热的过氧化氢酶，此前从未见过有关放线菌或嗜热放线菌产生过氧化氢酶的报道。为此，他们对该酶进行了纯化，并研究了酶的性质，发现其最适反应温度为60℃，根据对其吸收光谱的测定，估计该酶分子中含有血红素，还测定了它的一级结构。

在1990年前期，他们还从云南西双版纳温泉群中分离了220株耐热菌，从其中筛选到一株产生耐热中性蛋白酶的嗜热脂肪芽孢杆菌，对该酶进行了纯化并研究了酶学性质。

1990年5月，张树政出席在意大利维泰博（Viterbo）召开的首次国际嗜热菌研究会议，她在会上提供了一篇墙报，报告她的研究组在嗜热酶方面的研究成果。同时结识了一批国际同行。(www.guayunfan.com)随后，他们又从广东各地的热温泉水样（55℃～95℃）中分离了200余株最适生长温度高于70℃的极端嗜热菌，从其中筛选到一株含有耐热L乳酸脱氢酶的栖热菌，其最高生长温度为85℃，最低为40℃，所含乳酸脱氢酶的最适反应温度为60℃，在70℃保温10分钟仍保留85%的酶活力。

1994年他们又从嗜热脂肪芽孢杆菌中找到一种耐热的中性蛋白酶，这种酶在80℃保温3小时仍保留63%的酶活力，是已报道的耐热中性蛋白酶中耐热性较强的中性金属蛋白酶，且酶产率相当高，因此具有基础理论研究和实际应用的价值。他们对该酶进行了酶学性质的研究，证明该酶为一个六聚体，发现它对SDS和尿素等蛋白变性剂有一定抵抗力，作者认为这可能是由于亚基之间相互作用造成的，他们首先报道了蛋白酶以亚基间相互作用提高酶的耐热性的发现。随后他们又在枯草芽孢杆菌中克隆和表达了该酶。继而纯化了该表达产物，并研究了它的物理化学性质。

1995年，张树政研究组发表了“耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达”。这是他们研究集体开始采用基因工程技术从事极端酶研究取得成果的开始。由于耐热酶在常温菌中克隆表达，不仅可以解决原始菌酶产量较低的问题，而且由于常温宿主细胞中的蛋白质不耐热，可以用热变性手段除去大部分宿主蛋白，大大简化了酶的提纯步骤。张树政研究组利用自己构建的重组质粒Pbvt14在大肠杆菌中表达，因为使用了温控表达载体，省去了诱导剂，降低了成本，而且表达量比国外报道的重组酶的一万倍以上，有望用于生产基因工程中广泛使用的Taq DNA聚合酶。

1997年张树政指导她的学生发表了题为“嗜极菌的极端酶”的综述性文章，从极端酶的分离纯化、生化特性、极端酶的稳定因素，以及极端酶的应用等方面作了全面的叙述。并指出极端酶的研究，大大拓宽了人们对酶的特性的认识和生物催化剂的应用范围。但是，极端酶的稳定机制尚不清楚，工业化生产尚不成熟，实际应用也为数不多。相信随着研究的持续深入以及DNA重组技术的利用，极端酶的开发和应用将会出现诱人的前景。

在21世纪到来之前，张树政领导的研究组已经涌现了一批年轻有为，充满锐气的接班人，他们在原有工作的基础上，又从嗜酸嗜热（pH为2～3，可耐受pH为0.9～5.8，最佳生长温度70℃～85℃）的古菌芝田硫化叶菌的基因文库中扩增到一种过去没有报道的编码麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因，并在大肠杆菌中得到表达，表达产物占细胞总蛋白的4.4%，对于以淀粉为原料生产非还原糖和海藻糖具有较好的应用前景。随后，又进一步对该酶和麦芽寡糖基海藻糖基水解酶的基因进行了克隆，测定了它们的核苷酸序列，并进行了表达。还与已报道的其他微生物的两个海藻糖生成相关酶的基因进行了同源性比较。还从非解朊栖热菌染色体文库中，筛选得到耐热β糖苷酶基因，并在大肠杆菌中表达，酶比活力提高17倍。从结构与功能方面对其耐热证明疏水作用、盐键、α螺旋和脯氨酸含量高对该酶的热稳定性有重要贡献。

20世纪末发展起来的元基因组技术，为从那些迄今难以培养的极端环境微生物中获得极端环境微生物的基因提供了一条途径。张树政的学生们，在中国科学院微生物研究所的微生物资源前期开发国家重点实验室中，利用元基因组技术，从高温热泉中获得具有重大经济价值的新酶，开发出耐高温的超氧化物歧化酶（SOD酶），这被认为是这一技术在开发极端环境微生物资源成功的范例。他们采用未培养微生物技术，成功构建了国内唯一的腾冲高温热泉微生物元基因组文库，从热泉中获得的这种全新的具有完全自主知识产权的耐热SOD酶基因，该基因已申请获得国家专利保护（Zl200510005207.9），前期研究发现该SOD酶具有很好的热稳定性和催化活性，将具有很高的研究和应用价值。在“十一五”863重大课题“食品用酶及抗氧化酶的分子改良与产品研制”项目研究中通过对耐热SOD耐热性分析，获得了稳定性进一步提高的SOD突变体。通过细胞高密度发酵技术实现了SOD酶的大规模发酵生产。根据对这种酶的结构分析，对SOD酶与稳定性相关的氨基酸进行饱和突变，从中获得了高比活、高耐热性、高稳定性的SOD酶新型突变体，并成功将改良的耐高温SOD酶构建在毕赤酵母（Pichia pastoris）、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、里氏木霉高效表达载体上，获得高产基因工程菌。通过中试研究，优化了发酵培养基，建立连续补料高密度发酵工艺，使发酵产酶活力达到12000U/mL发酵液，耐高温SOD酶平均表达水平达到5mg/ml，比摇瓶水平提高了约20倍，该项技术达到了国际领先水平。然后确定了下游提取制备工艺，平均100L发酵液可得500g产品，酶活力达到2500～3000U/mg，回收率达到90%。该产品在80℃处理2小时酶活保持90%以上，100℃处理2小时酶活力保持在50%以上，在pH4～11.0范围内37℃处理3小时，酶活力均稳定在90%以上。此项技术于2009年8月转让给了北京中科国发科技有限公司，已建立了中试规模生产基地，开展试生产工作。SOD产品通过相关部门检测，重金属含量、细菌总数等指标均达到国家相关标准。目前正在制定相关企业标准和申请国家相关许可证书。如以年产200公斤耐热SOD的生产规模计算，按当前市场价格计算，预计销售额可达4000万元，利润不菲。目前也与有关化妆品公司合作，开展了该产品在化妆品中应用研究。