免疫学应用实验

时间：2022-05-13 理论教育版权反馈

【摘要】：1∶10稀释的伤寒沙门菌诊断血清、生理盐水；伤寒沙门菌和痢疾志贺菌24h琼脂斜面培养物；载玻片、毛细管。以双抗体夹心法为例，了解酶联免疫吸附试验的基本原理及其用途，并熟悉其操作步骤与注意事项。ELISA试验是将抗原、抗体反应的特异性与酶促反应的专一性和敏感性结合而形成的一种固相酶联免疫检测技术。ELISA既可用于测定抗原，又可用于测定抗体。本实验以双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒表面抗原为例。

实验任务三　免疫学应用实验

子任务一　玻片凝集实验

实验目的

初步认识玻片凝集实验的操作方法，了解其特点及用途。

实验计划

1.实验原理

在一定的条件下，颗粒性抗原与相应抗体特异性结合后，在玻片上可逐渐聚集并形成肉眼可见凝集现象。利用这一实验原理，通过观察是否出现凝集现象，即可鉴定待测标本所含有的菌种。

2.实验材料

1∶10稀释的伤寒沙门菌诊断血清、生理盐水；伤寒沙门菌和痢疾志贺菌24h琼脂斜面培养物；载玻片、毛细管。

3.实验步骤

①取洁净的载玻片，用记号笔标号划为3格，做好标记A、B、C。无菌条件下，用接种环于A、B两格内分别滴加1∶10稀释的伤寒沙门菌诊断血清1～2滴，C格中滴加1～2滴生理盐水。②无菌条件下，分别用接种环取伤寒沙门菌24h琼脂斜面培养物少许，混于C格和A格中，将细菌与生理盐水或诊断血清混匀，使之呈乳浊状液。③按相同方法取痢疾志贺菌24h琼脂斜面培养物少许，于B格内混匀。④结果观察。轻轻摇动载玻片，室温条件下反应1～2min后，肉眼观察各个格中是否出现凝集现象：出现乳白色凝集块者，则为阳性反应；仍为较均匀的乳浊液者，则为阴性反应。

4.注意事项

①用接种环取细菌培养物时取菌量不宜过多，使悬液呈轻度乳浊即可。②结果观察时，如果凝集结果用肉眼不易判断，可在光镜下进行观察。

实验实施

（1）实验途径：①实验形式：示教/操作。②操作形式：分组操作（4～6人/组）。

（2）实验结果：记录实验结果及实验过程中出现的问题。

（3）实验报告：记录实验结果。

子任务二　酶联免疫吸附实验

实验目的

以双抗体夹心法为例，了解酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理及其用途，并熟悉其操作步骤与注意事项。

实验计划

1.实验原理

ELISA试验是将抗原、抗体反应的特异性与酶促反应的专一性和敏感性结合而形成的一种固相酶联免疫检测技术。ELISA既可用于测定抗原，又可用于测定抗体。其敏感性高，特异性强，操作简单，用途广泛。本实验以双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）为例。其基本原理：在微孔板（酶标板）上预包被纯化的抗－HBs，抗－HBs可与待测样品中的HBsAg结合形成免疫复合物。加入以辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（抗－HBs－HRP）后，可形成（抗－HBs）－HBsAg－（抗－HBs－HRP）的双抗体夹心复合物。双抗体夹心复合物的形成量与待测HBsAg含量呈正比（在可检测范围内）。通过洗涤去除反应体系中的游离标记物和其他成分后，加入HRP相应的催化底物四甲基联苯胺（底物A）与过氧化氢（底物B），生成有颜色的产物。在特定的波长条件下，测定反应体系的光密度值（OD），从而确定待测样品中HBsAg的含量。

2.实验材料

①HBsAg诊断试剂盒（ELISA法）。②待测血清样品。③酶标仪，洗板机，温箱，微量加样器等。

3.实验步骤

（1）配制洗涤液：用蒸馏水或去离子水将浓缩洗涤液按1∶25稀释至500mL备用。

（2）加样：设空白对照孔1孔，阴性对照孔、阳性对照孔各2孔。分别加阴性、阳性对照品各50μL（1滴）和50μL待测血清于相应孔中。

（3）加酶标抗体：除空白对照孔外，每孔加50μL（1滴）酶标抗体，轻轻振荡混匀，用封板膜将孔和反应板封好。

（4）孵育：将反应板置于37℃温箱中孵育30min。

（5）洗涤：利用洗板机按照常规洗涤程序洗板4次后拍干。

（6）显色：每孔加底物A、底物B各50μL（1滴），轻轻振荡混匀后，置于37℃避光显色15min。

（7）测定：每孔加终止液50μL（1滴），轻轻混匀，用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值（30min内完成测定）。

4.结果判定

（1）临界值＝2.1×阴性对照OD均值（阴性对照OD值小于0.05时，以0.05计算）。