免疫浊度实验

实验41　免疫浊度实验

(Immune turbidity test)

【目的】

了解免疫浊度法的原理、操作过程及实际应用。

【原理】

抗原和抗体在液相中反应，所形成的免疫复合物使液相出现浊度，复合物的量与浊度呈正相关。这种浊度可以反射、散射和吸收入射的光线，使入射光衰减，因此可通过测定透射光衰减(以A值表示)或散射光强度来检测抗原-抗体反应。本实验以常用透射比浊法检测人血清IgG为例。在反应系统中IgG抗体过量时，所形成的免疫复合物与血清IgG量呈正相关，而形成的浊度大小与入射光的衰减呈正相关，因此测定A值反映液相中的抗原量，通过参照标准曲线或标准品数值的计算，即可得知待测血清中IgG的含量。

【材料】

1.标本:待测人血清、标准血清(混合正常人新鲜血清)、人IgG标准品(或冻干人血清IgG参考标准)。

2. PEG溶液: PEG 6000-8000 4.0g、NaF 1.0g、Na₂HPO₄·12H₂O 10.15g、NaH₂PO₄·2H₂O 1.0g、NaN₃0.1g，加蒸馏水至100m l。

3.其他试剂:羊抗人IgG抗血清、生理盐水、蒸馏水。

4.主要器材:分光光度计(721或731等)、水浴箱、微量移液器、刻度吸管、试管等。

【方法】

1.系列标准管准备:用生理盐水稀释人IgG标准品或人血清IgG工作标准，使其浓度分别为5.5g/L、11.0g/L、22.0g/L、44.0g/L(浓度可根据不同制剂略有变动)。取上述IgG标准液10μl，分放于4个试管中;另取生理盐水10μl，放于第5只试管中，作为空白对照。分别做好标记。

2.血清管准备:将待测血清和标准血清均做1∶10稀释(0.1ml血清＋ 1.0ml生理盐水)，各取10μl，分放于预先标记的试管中。

3.抗体制备:用PEG溶液稀释羊抗人IgG抗血清，注意保持适宜的抗体浓度。

4.抗原抗体反应:向各标准管和血清管中分别加入稀释抗血清，混匀后至37℃水浴30min。

5.测定:用分光光度计进行测定，使用340nm波长，用生理盐水校正零点。逐次测定各标准管和血清管，准确读取和记录各自的A值。

【结果】

1.以4个浓度的IgG标准品的A值为纵坐标，以其分别的IgG含量为横坐标，绘制出标准曲线。各血清管IgG含量可从标准曲线上查得。标准血清的IgG含量应该处于正常参考值的范围以内，否则应考虑实验结果可能有问题。

2.也可用分段直线计算法得到结果，举例如下:

标准管序号　　　　　　　1　　　　2　　　　3　　　4　　　　　

标准管IgG含量(g/L)　　 5.5　　　11.0　　22.0　　44.0　　　　

标准管A值　　　　　　　0.04　　0.08　　　0.14　　0.26　　　

血清管A值　　　　　　　　　　　0.10　　　　　　　　　　　　

以上例子中，血清管的A值位于标准管1和标准管3之间，计算如下:

(22.0－11.0)/(0.14－0.08)×(0.10－0.08)＋ 11.0=14.7(g/L)

3.正常血清IgG参考值为8.0～16.0 g/L。

【注意事项】

1.由于不同制品羊抗人IgG抗血清的效价不同，所以对每批制品都需要测定最适宜的抗体浓度。

2. PEG的分子量不同，性质也有所区别; PEG溶液浓度不同所沉淀的免疫复合物也不同，浓度越大沉淀的复合物越小。20g/L浓度只能沉淀较大复合物，40g/L浓度可沉淀较小复合物，但浓度＞50g/L，PEG选择性沉淀免疫复合物的特征即消失。

【临床意义】

1.血清IgG降低，主要见于先天性低IgG血症，例如Bruton型免疫球蛋白缺乏症和联合免疫缺陷病等。亦可见于获得性低免疫球蛋白血症，常低于5.0g/L，例如剥脱性皮炎、肠淋巴管扩张症、肾病综合征、淋巴肉瘤、霍奇金病等。

2.血清IgG升高，主要见于各种感染性疾病、肝脏疾病(慢性活动性肝炎、原发性胆汁型肝硬化等)和自身免疫病等。

【思考题】

1.免疫浊度实验的原理及试验中的主要注意事项是什么?

2.血清IgG异常时涉及哪些疾病?

3.免疫浊度法测定密切相关的因素有哪些?