线粒体和液泡系的超活染色与观察

实验六　线粒体和液泡系的超活染色与观察

活体染色是指对活细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动物、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也具有阴离子或阳离子，它们彼此之间就发生了吸引作用。活体染色剂要求对细胞无毒性或毒性极小，且要配成较稀的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）中的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B（Janus green　B）和中性红（neutral　red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

A.线粒体的超活染色与观察

一、实验目的

（1）了解动物、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。

（2）理解细胞器的超活染色技术的原理。

二、实验原理

线粒体（mitochondria）是细胞进行呼吸作用的场所，细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。线粒体的形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

三、实验用品

（1）材料：小鼠、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎。

（2）器材和仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、解剖器材、表面皿、恒温水浴锅。

（3）试剂：Ringer溶液、1%的1/5　000詹纳斯绿B溶液。

四、实验内容

（一）人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色观察

（1）取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5　000詹纳斯绿B染液。

（2）用一根事先灭菌的牙签在自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，将刮下的黏液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液）。

（3）取下载玻片，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体。

（二）小鼠肝细胞线粒体的超活染色观察

（1）用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。

（2）在干净的载玻片上滴加1/5 000詹纳绿B溶液，再将肝组织块移入染液。注意不可将组织块完全淹没，要使组织上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染20～30min）。

（3）吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散开。然后用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。

（4）在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1～2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。

（三）洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察

（1）用吸管吸取1/5 000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。

（2）用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展开，盖上盖玻片进行观察。

（3）在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧，紧贴细胞壁，胞质中可见一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状线粒体。

B.液泡系的超活染色与观察

一、实验目的

（1）了解动物、植物活细胞内液泡系的形态、数量与分布。

（2）理解细胞器的超活染色技术的原理。

二、实验原理

中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基复合体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。

三、实验用品

（1）材料：蟾蜍、小麦或黄豆幼根。

（2）器材和仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、解剖器材、恒温水浴锅。

（3）试剂：Ringer溶液、10%的1/3 000中性红溶液。

四、实验内容

（一）蟾蜍胸骨剑突软骨细胞的液泡系中性红染色观察

软骨细胞能分泌软骨黏蛋白和胶原纤维等，因而粗面内质网和高尔基复合体都发达，用中性红超活染色后，可明显地显示出液泡系。

（1）将蟾蜍处死，剪取胸骨剑突最薄的部分一小块，放入载玻片上的1/3 000中性红染液滴中，染色5～10min。

（2）用吸管吸去染液，滴加Ringer液，盖上盖玻片进行观察。

（3）在高倍镜下，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清楚易见，在细胞核的上方胞质中，有许多被染成玫瑰红色、大小不一的泡状体，这一特定区域叫“高尔基区”，即液泡系。

（二）小麦根尖细胞液泡系的中性红染色观察

（1）实验前，把小麦种子或黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根伸长到1cm以上。

（2）用双面刀片把初生的小麦或黄豆幼苗根尖（长1～2cm）小心切一纵切面，放入载玻片上的1/3 000中性红染液滴中，染色5～10min。

（3）吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。

（4）在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中存在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后由生长点向伸长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变小。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。

五、作业与思考题

（1）绘制口腔上皮细胞，示线粒体形态与分布（放大400倍）。

（2）绘制蟾蜍胸骨剑突软骨细胞，示液泡系形态与分布（放大400倍）。

（3）用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器？

（4）小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，伸长区细胞中液泡数量变少，染色浅？