急性中毒性肝损伤

第二节　急性中毒性肝损伤

实验目的

（1）学习复制小鼠四氯化碳（CCl₄）急性中毒性肝损伤模型。

（2）掌握小鼠股动脉取血方法和血清转氨酶测定方法。

实验原理

四氯化碳（CCl₄）对生物体有较强毒性，肝毒性尤为显著。给动物腹腔注射或灌胃后，能被迅速吸收，四氯化碳进入体内后，在肝细胞内质网中经细胞色素P450依赖性混合功能氧化酶的代谢，生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基。这些自由基可与细胞器膜和细胞膜的大分子共价结合，使膜结构的脂质溶解，从而影响线粒体等的结构和功能，使酶蛋白质合成减少，造成酶的破坏，因而影响代谢功能和能量的生成，致使肝细胞变性、坏死。同时胞浆内转氨酶渗入血液，血清转氨酶明显升高。本实验通过给小鼠腹腔注射CCl₄，造成急性肝功能不全，观察小鼠肝中毒后的行为改变及血清转氨酶的变化。

实验对象及相关用品

1.实验对象

小鼠，体重22g左右。

2.实验相关用品

分光光度计，恒温水浴锅，离心机，微量加样器，注射器，四氯化碳溶液（用花生油配制），生理盐水，丙酮酸钠标准液，谷丙转氨酶基质液，磷酸盐缓冲液（pH值为7.4），2，4-二硝基苯肼，0.4mol/L NaOH。

0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH值为7.4）：称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）11.928g，磷酸二氢钾（KH2PO₄）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL，调pH值至7.4。

丙酮酸钠标准液（2μmol/mL）：称取纯丙酮酸钠22.0mg，用磷酸盐缓冲液（pH值为7.4）溶解后移入100mL容量瓶，再用缓冲液稀释至刻度。临用前配制。

谷丙转氨酶基质液：称取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78g，加磷酸盐缓冲液少许，待完全溶解后移入100mL容量瓶，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，加1mol/L NaOH约0.6mL调pH值至7.4，加氯仿数滴，置冰箱保存。

2，4-二硝基苯肼溶液：称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用10mol/L盐酸10mL溶解后，加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。

1mol/L NaOH溶液：称取40g NaOH溶于适量蒸馏水中，然后稀释至1000mL。

0.4mol/L NaOH溶液：取1mol/L NaOH溶液400mL，用蒸馏水稀释至1000mL。

实验分组

实验组和对照组。

观测指标

一般表现、角膜反射、呼吸等，以上指标可反映肝中毒的表现；血清丙氨酸转移酶（ALT）、肝脏外观和形态，以上指标体现肝损伤的程度。

实验步骤

（1）取体重相近小鼠，分为对照组和实验组，观察一般状态、角膜反射、呼吸频率及幅度等。

（2）实验组小鼠腹腔注射0.8%CCl₄溶液0.1mL/10g，对照组小鼠注射等量生理盐水。小鼠禁食、不禁水过夜。

（3）造模24h后，仔细观察各鼠的一般表现。利用股动脉取血法采取血液并离心得到血清。动物处死后，取出肝脏并观察。

（4）血清ALT活性测定：首先，按下表加样，混匀，以空白管调零。520nm波长比色，读取各管吸光度算出回归直线，或以吸光度为纵坐标，以相当于每100mL血清的ALT单位数为横坐标绘制校正曲线。

然后，取试管4支，分别标明实验动物空白、测定管和对照动物空白、测定管。按下表加样。

加样完毕，摇匀，室温放置5min，用520nm波长比色，用空白管调零记录吸光度，代入回归直线或查找校正曲线求得ALT单位数。

注意事项

（1）采血及制备血清过程中，避免溶血。

（2）CCl₄用量一定要准确。

实验报告要点

回归直线或校正曲线要做标准。

思考题

1.肝损伤时血中哪些生化指标会发生改变？

2.怎样判别急性肝损伤的出现？