干细胞注射治疗脑卒中

长期以来,人类成年神经细胞被认为是不可再生性细胞。近年来从急性治疗时间窗内溶栓治疗到介入微创治疗,力求保护梗死区血供,从而保护“半暗带”神经元,挽救了部分患者的生命,但是仍无法取代缺损的神经功能而达到无后遗症的最终目标,20世纪90年代,能够发育成神经元和神经胶质细胞的神经干细胞的发现,冲破了旧有观念,开辟了治疗脑血管疾病的新天地。

不同于以往的治疗方法,神经干细胞治疗脑缺血损伤不是对抗神经病变的病理过程,而是通过其潜在的自我修复功能使受损组织得以新生,目前有关神经干细胞治疗脑缺血的研究主要集中在两个方面:①根据缺血后内源性神经干细胞被激活的特点给予外源性诱导,激活脑内成体神经干细胞从而达到修复损伤、恢复功能的目的;②应用外源性神经干细胞系进行移植治疗。

(一)内源性干细胞

在弄清脑缺血后神经干细胞激活、迁移、分化机制后,有可能人为诱导和加强内源性神经干细胞的激活,使其修复受损的神经网络,恢复功能。内源性神经干细胞的增殖、迁移、分化完全模拟胚胎时期神经系统的发育过程,能达到完全“无缝”修复;而且,内源性神经干细胞不存在免疫组织相容性的问题,与原组织有相同的细胞寿命。虽然这方面的研究尚无成功报道,但激活内源性神经干细胞自主修复中枢神经系统损伤是利用神经干细胞进行治疗的方向。

近年来的许多研究发现,局灶性脑缺血和全脑缺血都可以激活脑内多个部位内源性神经干细胞的增殖、迁移和分化,以试图代偿和修复受损的神经组织,从而在一定程度上改善神经功能的缺损。

一些实验结果提示局灶性脑梗死能诱导内源性神经干细胞的增殖、迁移和分化,脑缺血后的神经再生对神经系统结构和功能恢复具有重要意义,脑缺血后分化的神经元开始部分替代坏死的神经元重建神经回路并发挥作用而修复神经的功能缺损。国内中山大学的学者利用电针刺激治疗脑梗死,发现电针刺激可以促进内源性的神经干细胞增殖、迁移和分化。

掌握自体神经干细胞原位激活的调控机制,可以使机体自身修复脑缺血损伤成为可能。但是缺血后神经干细胞自身激活的机制十分复杂,受到多种因素的影响,目前较为明确的是兴奋性氡基酸受体途径、细胞因子、炎症与凋亡等参与了缺血诱导的内源性神经干细胞激活。

兴奋性氨基酸受体途径参与神经干细胞的增殖、分化。正常状态下,N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗药MK2801或α-氨基-3-羟基-4-异唑-丙酸(AMPA)受体拮抗药NBQX对沙土鼠海马齿状回的神经干细胞增殖起促进作用。而脑缺血状态下, MK2801和NBQX对神经干细胞的作用则相反。Arvidsson等发现,MK2801可以完全阻断脑缺血2小时引起的神经干细胞增殖,同时也抑制了脑缺血后海马CA区突触素的表达,提示兴奋性氨基酸受体活性下降对脑缺血诱导的神经干细胞增殖及突触的形成有抑制作用。

脑梗死后多种生长因子和细胞因子的释放增加可能是神经干细胞激活的另一个重要原因。短暂性脑缺血再灌注后1小时,海马区的bFGF2mRNA水平开始升高,一直持续到2周后,其表达的时间与脑缺血后神经元再生的规律基本一致。Jin等研究发现低氧介导的体外培养大脑皮质神经干细胞再生时,干细胞因子(SCF)水平增高,而这种增高能促进正常氧含量下培养的细胞与BrdU的结合;在体内实验中,脑缺血后SCF的受体c2kit在海马齿状回和侧脑室下区的表达也升高,提示干细胞因子参与了缺血诱导的神经再生。由此可见,脑缺血损伤后bFGF2和SCF可能参与SVZ和SGZ的神经再生过程。另外,脑缺血也促进脑源性神经营养因子BDNF和神经生长因子(NGF)的表达,这些因子具有促进神经干细胞增殖分化及新生神经元存活的作用,但这一观点目前仍存在争议。Larsson等将携带有BDNF基因的腺病毒载体注入海马后,BDNF在海马的长期表达并没有促进海马的神经再生反而抑制齿状回颗粒细胞的再生。睫状神经营养因子(CNTF)也是调节脑内神经干细胞增殖和分化的重要因子。缺血性脑损伤可诱导损伤部位CNTF表达和合成增加,CNTF表达水平的增高不仅可以保护受损的神经元,而且还可以促进脑内神经干细胞的增殖并向星形细胞和小胶质细胞分化。

炎症与凋亡机制参与脑缺血后的神经再生。Kumihashi等实验发现,阿司匹林可以减少脑缺血后神经干细胞的增殖。由于阿司匹林是环氧合酶的非特异性受体,提示环氧合酶和前列腺素在缺血后神经细胞增殖中可能发挥重要作用。凋亡在神经再生中也发挥作用。caspas通路的抑制药可降低海马齿状回凋亡的发生,同时可以增加该区增殖细胞的数量。

有关实验证实5-羟色胺(5-HT)和促红细胞生成素(EPO)也可能参与内源性神经干细胞的激活。5-HT是神经元前体分化为神经元的启动信号,它可以促进皮质和海马神经元的分化。缺血性脑损伤可使脑组织中5-HT的释放增加,从而调节脑缺血后神经元的再生过程。Brezun等发现,抑制5-HT合成和选择性破坏5-HT神经元,均可减少海马齿状回和侧脑室下区新生细胞的数量。后来继续的研究发现,彻底破坏背侧和中缝核5-HT神经元可导致BrdU和PSA-NCAM阳性标记的新生颗粒细胞长时间减少,提示5-HT可能是成年动物颗粒细胞增殖的正性调节因子。脑缺血后EPO水平的升高也可能是影响脑缺血后神经再生的因素之一。脑缺血缺氧可诱导EPO在星形胶质细胞的表达,引起EPO水平升高,同时EPO受体在侧脑室下区的表达也升高。脑缺血后脑内EPO及其受体水平的升高是一种内在的缺血反应,有助于神经干细胞向新生神经元的分化和脑缺损功能的恢复。将EPO注入成鼠侧脑室后,EPO作用于神经干细胞促进神经前体细胞的迁移,增加嗅球新生神经元的数量,而EPO抗体则减少上述迁移细胞的数量。可见,EPO也参与了缺血后内源性干细胞的激活。

有研究发现,脑缺血后缺血侧海马神经元环路中电变化活动可能是激活该侧神经干细胞增殖的重要机制之一,提示钙超载参与了缺血后内源性干细胞的激活。Yamada等通过研究离子通道发现干细胞增殖受到Ca2+通道的调节,脑缺血后Ca2+通道持续开放,引起细胞内离子变化,分泌大量支持细胞分裂后存活的因子,激活干细胞进入细胞周期。

内源性神经干细胞治疗具有无需取材、无需培养、无需移植的特点,利用内源性神经干细胞治疗脑缺血疾病解决了干细胞的来源问题,而且不存在伦理学的争论和免疫排斥反应。但内源性神经干细胞的数量有限、增殖的神经干细胞极少向神经元分化,而且调节干细胞增殖、迁移、分化、存活和突触形成的因子不足,使得治疗效果不尽如人意。在大多数情况下,仅由内源性干细胞产生的神经组织可能不可以替代损伤后缺失的神经组织,尤其在像脊髓、纹状体等神经组织发生很少的部位。因此进一步探讨脑缺血后内源性神经干细胞增殖和分化的内部条件,也可以给予外源性营养因子进一步增强内源性神经干细胞的活化,利用一些手段扩大内源性神经干细胞的作用,促进其增殖并向缺血坏死灶迁移,诱导分化为神经元,使细胞实现自我修复,有待于进一步的研究。

(二)外源性干细胞移植治疗脑梗死应用研究

脑缺血损伤后仅仅调动内源性神经干细胞试图自我修复是不够的。迄今为止,人们尚缺乏足够的证据来评价内源性神经干细胞的激活在脑缺血神经功能恢复方面所起的作用。因此,在现有内源性神经干细胞修复研究的基础上,外源性途径即通过实验室分化的神经细胞移植到患者体内成为多数学者研究的方向,人类干细胞移植治疗的方法已广泛应用于造血系统的肿瘤、淋巴瘤、其他血液系统的疾病以及自身免疫系统的疾病。目前干细胞移植治疗的临床试验已在其他肿瘤、心脏疾病、糖尿病等疾病中进行。此外,第一个人类神经干细胞移植治疗的临床试验最近已经被批准应用于少年型家族性黑矇性痴呆,这些治疗研究进展所获得的经验,有助于解决有关干细胞移植治疗卒中前景的关键问题。在外源性干细胞脑内移植治疗缺血性脑卒中的研究中,神经干细胞直接移植的实验研究最多。缺血性脑卒中的动物实验已经证实:给缺血性脑卒中大鼠注射外源性神经干细胞能够表现出行为功能的明显改善,并在组织学检查时观察到梗死区体积减小,半暗区有外源性干细胞分化的神经元和少突胶质细胞增多,神经元样细胞与宿主细胞产生了突触联系。Ishibashis等将从人类胎儿前脑分离得到的人类胎儿神经干细胞移植入发病后4天的蒙古沙鼠脑缺血区,4周后发现,梗死区体积显著小于对照组,感觉运动显著改善,提示外源性人类神经干细胞移植是缺血性卒中富有前景的有效治疗手段。

研究已经证明干细胞移植治疗脑梗死有着巨大的应用前景,来源于人的多种类型的干细胞已在卒中实验模型中试验过,在一些试验中部分行为学功能的指标有改善。移植治疗脑缺血研究中人类细胞来源有以下二类:①从胚胎组织来源的神经干/祖细胞(NPCs);②永生化的神经干细胞;③造血/内皮祖细胞,从骨髓、脐带血、外周血、脂肪组织中分离出来的基质细胞等。

1.神经干/祖细胞 神经干细胞和永生化的神经干细胞通过脑内直接移植或通过静脉注入移行到卒中受损部位周围能存活、分化,并能增强功能的恢复。通过两种移植途径,发现移植的细胞归巢到受损的部位,这种有目的的迁移可能是受到损伤后诱导的化学增活素的介导,如间质细胞诱导因子-1、单核细胞诱导蛋白-1。移植前神经干细胞给予不同的预处理,移植后分化为神经元和胶质细胞的比例不一样,但很少发现少突神经胶质细胞。这种细胞分化类型的不同可能由下面两种原因导致:细胞内在因素(不同的干细胞具有不同的发育潜能),外在的因素(移植的微环境),移植的微环境能影响干细胞移植物的分化结果。但在功能恢复和移植细胞不同的分化结果之间没有明显的相关性。

2.人畸胎瘤神经元(人NT神经元) 永生化NT2细胞系来源于人畸胎瘤组织,为有丝分裂期后的未成熟的神经元。这些未分化的人NT细胞可长时间维持其自身的神经元表型而不会恢复到原来的肿瘤状态,在体内外可维持1年以上的时间,当把永生化NT2细胞以剂量依赖的方式移植到缺血损伤的鼠纹状体可以增强功能的恢复。动物行为的改善与移植的细胞存活时间一样长,可维持到移植后6个月。但是,存活的移植细胞与功能的恢复不一定总是相关,因为有关研究发现当把这些细胞移植到缺血皮质时尽管细胞存活非常好,但功能基本上没什么改善。目前这种人NT神经元在美国已经应用于治疗基底节区的缺血性卒中1期和2期临床试验中。

3.骨髓、脐带血、外周血、脂肪组织中分离出来的干细胞 已有几组研究报道人骨髓细胞(HBMC)、人脐带血细胞(HUCBC)、外周血祖细胞、脂肪组织中分离出来的间充质干细胞通过脑内直接移植或通过静脉注入都能增强缺血卒中动物模型神经功能的恢复。HBMC、HUCBC中很多种细胞类型构成,包括造血干细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、未成熟的淋巴细胞、未成熟的单核细胞等,由于不同的细胞都有可能增强功能的恢复,所以还不明了这细胞中到底是哪种细胞在卒中移植治疗中对于功能的恢复起主要作用。无论是通过脑内直接移植或通过静脉注射,HBMC、HUCBC和移植的神经干细胞一样可靶向迁移到缺血区域,认为也可能是受到缺血损伤诱导的化学增活素的介导作用。但是在移植的脑区内几乎找不到移植的细胞,即使通过脑内直接移植细胞的方法,在找到的少数存活细胞中也只有比例非常小的细胞表达神经元的标志。假设这些少量存活的移植细胞全部变成神经元,它们也不可能完全修复替换受损的脑组织。所以这种功能的恢复作用不是细胞本身起作用,而比较可能的是由于这些细胞分泌的营养因子的作用,分泌的某些营养因子增强了脑的内源性修复机制。通常移植非常少量的细胞到脑内也可以使功能有所恢复,提示移植的细胞在死亡之前对脑组织可能发挥了急性短期的作用,而没有持久的作用。通过静脉注入移植的细胞可能不需要进入脑内发挥作用,可能是在外周发挥作用增加脑内营养因子的表达。实验研究表明HBMC的营养作用可通过基因工程来增强表达营养因子。

造血系统来源的细胞其优点是避免了胚胎及胎儿伦理道德的和组织来源限制的问题。HBMC和外周血干细胞可提供自体移植物,这样不需要使用免疫抑制药。最重要的优点是这些细胞已经在临床上广泛应用,并治疗过各种良性或者恶性疾病积累了干细胞移植的经验。此外,HUCBC移植治疗小儿外伤性脑损伤的临床治疗在美国已经获得批准,这是第一个批准的临床试验中应用HUCBC治疗神经障碍疾病。

有对照实验研究显示,使用非人的神经干细胞,包括成体的、胚胎的、胎儿来源的神经干细胞移植治疗脑缺血都可以促使神经功能恢复,这些细胞显示了良好的迁移能力,即使通过对侧移植,都可迁移到缺血损伤区。一项研究中证实,对侧半球移植所取得的效果与细胞移植到局部缺血的半球的疗效相似。动物实验证实使用胚胎干细胞移植治疗脑缺血提示了有肿瘤形成的风险。