项目三 层析技术
层析技术（层析法）也称为色谱法，因早期分离植物色素而得名。
一、基本原理
层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
二、相关基本概念
（1）固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。
（2）流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
三、层析技术分类
（一）根据操作形式不同分类
1.柱层析
将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
2.纸层析
用滤纸做液体的载体，点样后用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。
3.薄层层析
将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品的分析、分离。
（二）根据流动相存在状态不同分类
分为气相层析和液相层析。
（三）根据原理不同分类
1.吸附层析
吸附层析是最早建立的一种层析分离方法。当混合物各组分随流动相流经固定相吸附时，在两相界面不断发生着吸附和解吸附过程，由于吸附剂对不同物质具有不同吸附力，故能使各组分彼此分离。吸附包括物理吸附和化学吸附，常用硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、聚苯乙烯、羟基磷灰石等作吸附剂，用液态烷、卤代烷、酮、醇、醚、有机酸等作流动相。
2.分配层析
利用混合物在两相（固定相和流动相）之间分配系数的不同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。
分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数（Kd）。分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动慢。因此，可彼此分开。物质在载体上的移动速率可用Rf表示。
Rf＝色斑中心到原点中心的距离/溶剂前缘至原点中心的距离
物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
3.离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，当流动相中带电粒子流经固定相时，将固定相中带同种电荷的离子交换下来，而自身被固定结合。不同组分的离子交换能力不同，从而将各组分彼此分离。
离子交换剂包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖凝胶三类。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物以共价键形式结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂能与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。洗脱液常用具有一定pH值的酸类、碱类或盐类缓冲液。
4.凝胶层析
凝胶层析（分子筛层析）是当生物大分子随流动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，且移动速度快；比网孔直径小的分子能不同程度地自由出入凝胶孔内外，在层析柱内经过的路程较长，移动速度较慢，据此可将分子大小及形状不同的组分分离。洗脱液常用有机溶剂或具有一定pH值的盐类缓冲液。
5.亲和层析法
亲和层析（affinity chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。
亲和层析的分离原理就是将具有亲和力的两个分子中一个（配体）固定在不溶性载体上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。常用的载体有琼脂糖、PAG等。将配体结合到载体的方法，一般是先将载体功能基活化，再与配体以共价键形式结合。当流动相中待分离的亲和物流经固定相时，与配体专一结合，其他杂质随流动相洗涤下来，然后再用洗脱剂将亲和物洗脱、收集。
层析分离技术具有分离效果好、操作简便的优点，与检测系统和微机结合，还可以组成各种自动化的分离、分析仪器，如高效气相色谱仪、高效液相色谱仪等，这些仪器广泛用于化学物质和生物大分子的分离、分析。
6.高效液相色谱
（1）高效液相色谱仪：高效液相色谱（high performance liquid chromatography，简称HPLC）又称作高压液相色谱（high pressure liquid chromatography），按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似，但需在色谱仪中进行。高效液相色谱仪一般由溶剂槽、高压泵、分析柱、进样器、检测器、部分收集器、记录仪、数据处理机等单元组成，有的还有梯度仪和流量测量装置。
（2）高效液相色谱的特点及应用：高效液相色谱是吸收了普通液相层析和气相色谱的优点，再经过适当改革发展起来的。它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性的物质），又有气相色谱的特点（即高压、高速、高分辨率和高灵敏度）；它不仅适用于很多不易挥发、难热分解物质（如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等）的定性和定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。特别是近年来出现一种与HPLC相近的快速蛋白液相色谱（fast protein liquid chromatography，简称FPLC）能在惰性条件下，以极快的速度把复杂的混合物通过成百上千次层析分开。如果连续进样，一天内可制出大量的欲纯化物质。
目前，HPLC在生物化学研究中已得到广泛应用，主要表现在以下几个方面。
①对脂肪族低级醇、醛和酮，可用高效液相色谱法获得很好分离；对于芳香族醇、醛和酮，或者含有芳香环、杂环等可吸收紫外光的醇、醛和酮，用高效液相色谱法分离最合适。
②气相色谱法虽能分离烃类化合物，但它在分析相对分子质量大和挥发性低的烃类化合物时受到限制，而高效液相色谱法却可补偿其不足。对于芳香烃及其衍生物用高效液相色谱法尤为合适。
③维生素是一类重要的药物。高效液相色谱法用于分离无论是脂溶性的还是水溶性的维生素，其结果都比使用其他方法好。
④各种类型的甾族化合物均可用高效液相色谱法成功地分离。吸附色谱法、液－液分配色谱法和反相色谱法都可用来分离甾族化合物。
⑤用高效液相色谱法分离糖，通常不需要衍生化，在多数情况下也不需要对样品进行预处理。分离糖可以使用吸附色谱法，如在硅胶柱上用甲酸乙酯∶甲醇∶水（6∶2∶1）为移动相分离果糖、蔗糖、山梨糖和乳糖。
⑥在通常的高效液相色谱仪上，也可进行氨基酸和肽的分离工作。
⑦近年来，用高效液相色谱法分析脂肪酸的工作取得迅速的进展。
⑧生物碱是从植物中提取得到的含氮的一类碱性化合物，其种类繁多，如吗啡、可待因、海洛因、蒂巴因等，可用液－液分配色谱法进行分离。
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