北虫草的菌种制备

任务二　北虫草的菌种制备

北虫草与冬虫夏草有效成分的种类极为接近，近年来北虫草人工栽培尤为活跃，由于虫草菌种在所有真菌中变异退化最快，所以学习北虫草优良菌种的选育方法极为重要。

一、北虫草培养基的配制

（一）菌种分离

平板马铃薯、葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH值7.0，121℃灭菌30分钟。

（二）液体摇瓶

沙氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，去离子水1000mL，pH值7.0，121℃灭菌30分钟。

（三）悬浮培养

液体发酵培养基：葡萄糖1%，动物蛋白2%，玉米浆1%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.1%，柠檬酸氨0.1%，pH值7.0，121℃灭菌30分钟。

二、北虫草的菌种分离

（一）孢子分离培养

操作前无菌室和超净台用紫外线灭菌30分钟，分离过程严格遵守无菌操作规程。在超净台内点燃酒精灯，操作器具火上烧灼消毒。用灭菌手术解剖刀在成熟虫草的孢子部位划口，然后用手向平皿培养基指弹3～5次，使孢子接种于平皿培养基，移置生化培养箱中21℃～23℃条件下培养3～4天，在培养基上就可长出白色星芒状菌落。挑取孢子萌发密集部位的菌落进行液体发酵培养。

（二）组织分离培养

无菌操作规程同上。用拧干的75%酒精棉球擦洗子实体表面消毒，用灭菌手术解剖刀去皮。在成熟虫草子实体顶部膨大与虫草柄相交部位组织切取一小块组织，约大米粒大小，直接接种于100mL或500mL三角瓶液体培养基中。置摇床21℃～23℃，115r/min培养48小时。菌液清澈透明，菌球谷粒大小，呈白色半透明状，菌球占70%～80%。

三、菌种悬浮深层发酵

挑取平板培养基孢子菌落接种于100mL或500mL三角瓶液体培养基中。置摇床21℃～23℃，115r/min培养48小时。然后转接于含有1000mL液体培养基的细胞悬浮培养瓶中，置于暗室，放在磁力搅拌器上。室温控制在21℃～23℃，搅拌速度调整在115r/min，继续培养48小时，菌液清澈透明，菌球谷粒大小，呈白色半透明状。菌种为振摇培养4天的二级菌种。

将组织块直接培养48小时的清澈透明菌液接于含有1000mL液体培养基的细胞悬浮培养瓶中培养，置于暗室，放在磁力搅拌器上。室温控制在21℃～23℃，搅拌速度调整在115r/min，继续培养48小时，获得发酵周期为96小时的一级菌种。

思考与练习

1.北虫草培养基的配制方法有哪些？

2.简述北虫草菌种分离的方法。

3.简述北虫草菌种悬浮深层发酵的过程。