贝类多倍体诱导和倍性检测

实验十四　贝类多倍体诱导和倍性检测

一、实验目的

（1）掌握贝类物理诱导多倍体的原理、一般方法以及倍性检测方法。

（2）初步了解贝类多倍体育种过程。

二、实验原理

多倍体诱导的方法主要分物理诱导、化学诱导和生物诱导三类。物理方法是在细胞分裂周期中施加物理处理影响和干预细胞的正常分裂，常用的物理方法有温度休克法（包括高温和低温休克法）和水静压法。

温度休克法的作用机制是通过温度的变化（高温或低温）引起细胞在短时间内酶构型的改变，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺锤体所需的ATP的供应途径受阻，使得染色体失去移动的动力，从而抑制染色体向两极移动，形成多倍体细胞。所用的温度因种类不同而有所差异。温度休克法是诱导水生动物多倍体的常用手段，根据处理温度的高低分为冷休克（cold stock）和热休克（heat stock）。一般热休克采用30℃～35℃的高温，冷休克采用0℃～4℃的低温，处理持续时间10～20min。温度休克法诱导三倍体，操作简单，成本低廉，尤其是低温休克法对胚胎发育的影响较小，适合于大规模的生产。太平洋牡蛎的受精卵经0℃～4℃的低温休克后，胚胎孵化率可高达90％以上，稚贝的三倍体率达80％以上。

三、实验材料

性成熟的牡蛎。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

显微镜，离心管（或培养皿），解剖刀，剪子，镊子，吸管，恒温水浴锅，乙醇灯，载玻片，温度计，计时器，烧杯，搅拌器，筛绢等。

2．药品试剂

秋水仙素，甲醇，冰醋酸，磷酸缓冲液（pH 6．8～7）。

五、实验步骤

（1）先把成熟的牡蛎外壳洗刷干净，活体解剖，敲开贝壳检查、分选雌雄牡蛎。雌体的卵子呈分散颗粒状，分散快；而雄体的精子呈乳块状，不见颗粒，分散慢。

（2）摘取生殖腺，剖取卵子，先用300目筛绢过滤一次，再用500目筛绢洗去组织液，卵子最好用海水浸泡30min。取精子授精；水温保持23℃～25℃。

（3）当受精卵发育至第一极体出现率达50％时，放置在0℃～4℃环境中处理10～30min。分别记录低温处理的起始时间和持续时间。

（4）处理毕，用23℃～25℃过滤海水冲洗卵子，并在此温度下培养，统计受精率及孵化率。

（5）发育至4～8细胞期，进行三倍体率检查。采用胚胎压片法（同实验十二），计数每个胚胎细胞中期分裂相的染色体数，确定其倍性。

（6）多倍体检测也可采用流式细胞仪，详见实验十六。

六、作业

（1）记录各处理组低温处理的起始时间、持续时间。

（2）记录各处理组胚胎的受精率、孵化率、多倍体率，完成下列表格。

（3）分析低温诱导多倍体率高低的影响因素有哪些。

表14．1　低温处理的起始时间、持续时间与胚胎的受精率、孵化率、多倍体率的关系