及血凝抑制（

实训七　血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验

一、目的要求

熟练掌握HA-HI试验（微量法）的操作方法及结果判断。

二、仪器及材料

生理盐水、1％鸡红细胞、新城疫病毒液、新城疫标准阳性血清、新城疫标准阴性血清、新城疫待检血清、96孔V形微量反应板、微量移液器、吸头、温箱等。

三、方法与步骤

（一）HA试验

1.取洁净的微量反应板，用微量移液器自1～12孔各加生理盐水50uL。

2.用微量移液器吸取50uL新城疫病毒液加入第1孔，吹吸混匀，吸取50uL 加入第2孔，吹吸混匀，吸取50uL加入第3孔……如此依次倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取50uL弃掉，第12孔不加，作红细胞对照。

3.用微量移液器向1～12孔各加1％鸡红细胞50uL。将微量反应板放在微量振荡器上（或用手做旋转）混匀，置37℃温箱作用15～min，待第12孔的红细胞完全沉淀后判定结果并记录。

4.判定结果：以100％凝集（血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底）的病毒最大稀释度为该病毒血凝价（凝集效价），即一个凝集单位。不凝集者沉于孔底呈点状。把反应板倾斜45°后，从反应板背面可看到不凝集的红细胞会流成一条红线，凝集的红细胞凝成均匀的薄层，不流动。

HA试验的操作术式见表3。

表3　HA试验术式表（单位：μL）

注：#表示100％凝集；++表示50％凝集；-表示不凝集。

从上表看出，本病毒的血凝价为1∶64（1∶2⁶），即此浓度的病毒液含有1个凝集单位。

（二）HI试验

根据HA试验结果，配制4个血凝单位病毒溶液。

若病毒液的血凝集价为1∶64（1∶2⁶），那么含有4个血凝单位病毒溶液的浓度为1∶16（1∶2⁴），把原病毒液稀释16倍（mL病毒液，mL生理盐水混匀），即配成含有4个血凝单位的病毒液。

1.取洁净的微量反应板，用微量移液器自1～12孔各加生理盐水50uL。

2.用微量移液器吸取50uL待检血清加入第1孔，吹吸混匀，吸取50uL加入第二孔，吹吸混匀，吸取50uL加入第三孔……依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取50uL 弃掉，第11孔不加，作病毒对照，第12孔加50uL阳性血清，作阳性对照。

3.1～12孔各加4单位病毒液50uL，混匀，置37℃温箱作用15～min。

4.用微量移液器向1～12孔各加1％鸡红细胞50uL。将微量反应板放在微量振荡器上（或用手做旋转）混匀，置37℃温箱作用15～min，待第11孔的红细胞完全凝集后判定结果并记录。

5.判定结果：以100％抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度，即血清效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，可判定该病毒为新城疫病毒。

HI试验的操作术式见表4。

表4　HI试验术式表（单位：μL）

从上表看出，该被检血清的HI效价为1∶2⁴。

在生产中，对免疫鸡群进行抗体监测时，可直接用4单位病毒液稀释血清，其方法为：

1.第1孔加8单位病毒50uL，第2～11孔各加4单位病毒液50uL。

2.第1孔加50uL待检血清。自第1孔开始混合后吸50uL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔吸弃50uL，第11孔不加作病毒对照，第12孔加50uL阳性血清，作阳性对照。混匀置37℃作用15～min。

3.自1～12孔各加1％鸡红细胞50uL，混匀后置37℃作用15～min，待对照病毒凝集后观察结果。

4.判定结果：以100％抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度。

四、知识链接

HA-HI实验相关试剂的配制。

1.1％鸡红细胞的制备：先用灭菌注射器吸取灭菌的3.8％枸橼酸钠溶液（其量为所需血量的1/5），从健康鸡翅静脉（或心脏）抽血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以r/min离心min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成1％悬液。

2.Alsever（阿氏）红细胞保存液：枸橼酸钠0.g，枸橼酸0.g，氯化钠0.g，葡萄糖2.g，双蒸水mL。将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH值为6.8，115℃灭菌min，4℃保存备用。