沉淀类试验

第二节　沉淀类试验

沉淀类试验包括琼脂凝胶免疫扩散试验、环状沉淀试验和絮状沉淀试验等。琼脂凝胶免疫扩散试验是一种比较经典而且方便适用的方法。琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖，高温时能溶于水，冷后凝成凝胶，内部形成一种多孔的网状结构，而且孔径很大，可允许大分子物质（分子可达百万以上）自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度，琼脂浓度大，孔径相对较小，琼脂浓度小，孔径相对较大。1%琼脂凝胶的孔径约为85nm，由于琼脂或琼脂糖具有很好的化学稳定性，制成凝胶后含水量大，透明度好，来源方便，易处理，因此是一种很好的扩散介质。抗原和抗体的分子量一般都在20万以下，在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受的阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同，在凝胶中的扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物。若两者在相遇处比例适当，由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，这样的沉淀就形成了一个“特异性屏障”，凡在免疫学上与其相同的抗原或抗体分子不能通过，而性质不同的那些分子可以通过这个屏障而继续扩散，直到形成它们自己的复合物为止。这样，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置，从而有可能将混合物分离开来，进行比较研究。这种反应称为琼脂凝胶免疫扩散，或琼脂扩散。

一、琼脂凝胶免疫扩散试验

琼脂凝胶免疫扩散试验（或称免疫扩散），其形成的线状带具有特异性和交叉性。抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质。抗原分子表面具有特殊构型的有免疫活性的化学基团，称为抗原决定簇。抗体是在抗原刺激下产生，并能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。一个抗体分子上有两个可变区，可变区决定了每种抗原决定簇均有其对应的一种抗体。抗血清是针对不同抗原决定簇的抗体混合物，一般从免疫动物的血清获得，因此称抗血清。

抗原决定簇与其对应的抗体结合，形成抗原抗体复合物，这是一个一对一的反应过程。具有高度的特异性。所有血清反应都是以此为基础的，因此具有高度的特异性。琼脂凝胶免疫扩散试验也不例外，同样具有高度特异性。一种抗原往往具有多种抗原决定簇。不同抗原可能存在相同的抗原决定簇。同一种抗体分子与不同抗原中存在的与该种抗体相对应的相同抗原决定簇之间的反应就是血清学反应中的交叉反应。应当注意，这种交叉反应也是特异性的，而且是血清学反应所固有的。琼脂扩散试验同样也存在一定的交叉反应。因此，琼脂扩散试验的特异性还依赖于抗原或抗体的纯度。提供具有高纯度的高特异性的抗原或抗血清，对琼脂扩散试验的特异性是至关重要的。可使用单克隆抗体以提高反应特异性。有时抗体分子与抗原决定簇的结合反应并不总是一对一的，抗体分子有时会与不对应的、但在化学结构上极其相似的抗原决定簇结合，这就是非特异性反应。非特异性反应的产生并不总是由于抗体对抗原决定簇的识别错误所引起，与反应有关的其他因素，如离子强度、pH等也会造成非特异性反应的产生。

琼脂扩散试验的敏感性依赖于琼脂的浓度、凝胶的厚度、黏性和抗原、抗体的浓度。比较而言，单扩散试验的敏感性要高于双扩散试验。

在单扩散试验中，加入到凝胶中的抗体的浓度对敏感性起决定作用。若浓度较小，则敏感性就高；反之，敏感性就低。就双扩散试验而言，试验的敏感性依赖于抗原孔和抗体孔之间的距离，以及抗原、抗体的相对浓度。孔间距减小，敏感性提高；孔间距增大，敏感性降低。抗原抗体的相对浓度对试验的敏感性也是很重要的。

（一）分类

琼脂免疫扩散试验根据抗原抗体中一种成分扩散，另一种成分不扩散或两种成分在凝胶内彼此都扩散则分为单扩散（Simple diffusion）和双扩散（double diffusion）。又根据扩散物质的扩散方向可分为单向扩散（one－dimensional doffusion）和双向扩散（two－dimensional diffusion）两类。扩散物质向一个方向直线扩散者称为单向扩散；扩散物质同时向两个垂直的方向扩散，或向四周辐射扩散者称为双向扩散等。在诊断实践中最常用的是双向扩散试验，一般所称的琼脂扩散试验多指双向扩散试验。

1.单向单扩散试验（simpl ediffusion in one－dimension）Oudin于1946年首次记述了本方法，因此也称为Oudin法。本法主要用于对抗原成分的分析研究和抗原鉴定等。目前已少用。但由于本法是一种经典试验，具有一定的代表性，故在此作一叙述。

（1）材料和方法

①试管准备：单向单扩散试验常在细小试管、毛细管或特制的玻璃小管内进行。这种管的规格为：内径1.6～2.0mm，管壁厚0.2～0.5mm，长100mm。由于琼脂凝胶一般不易附着于玻璃表面，为防止试验样品从凝胶和管壁间的小缝渗漏，因此最好事先用琼脂凝胶包被小管内壁。包被的方法是将小管在60℃～70℃水浴中预热，勿让水进入小管上的冷凝琼脂。最后将附于管壁的琼脂凝胶中的水分用真空泵抽干或阴干。用于包被的琼脂凝胶中不能加入任何盐分，否则干后会有盐晶体析出，影响试验结果。

②凝胶琼脂制备：琼脂凝胶常用缓冲液配制。琼脂（agar）或琼脂糖（agarose）的最终浓度为0.2%～0.5%，同时可加入终浓度为1∶4～1∶20的对应抗血清，并混合均匀。趁热将含有抗血清的琼脂细心地加入到已准备好的小管内。加入的高度为35～40mm，待冷凝后于4℃湿盒内保存备用。

③加样与扩散：在含有抗血清的琼脂上层滴加高度约为3mm的待测抗原，然后置湿盒内于恒温下扩散。扩散时常用温度为37℃。

（2）结果判定与分析

①反应特点：抗原在含有抗血清的琼脂凝胶中扩散形成浓度梯度，在比例适当处形成沉淀带。此沉淀带随着抗原向前扩散移动，并达到平衡状态。最初形成的沉淀带（precipitationzone）随着抗原扩散而逐渐增大，造成抗原过剩而重新溶解，故沉淀带的后缘模糊，而前缘齐平。

当反应物中仅存在一对抗原抗体时，只出现一条沉淀带；当存在两对或两对以上抗原抗体时，则理论上每对抗原抗体可形成各自的沉淀带。

②各试验因素对结果的影响：抗原抗体界面至沉淀带前缘的距离称为沉淀带的穿透力（penetration）。穿透力与扩散时间的平方根成线性正比关系；穿透力与抗原的初始浓度成正比；穿透力与凝胶中的抗体浓度成反比。

2.单向双扩散试验（double diffusion in onedimension）本试验方法用内径8mm的试管，先将含有抗血清的琼脂加于管底，高约6mm，中间加一层同样浓度的琼脂，凝固后加待检抗原0.25ml，于37℃或室温下扩散数日。抗原抗体在中间层相向扩散，在平衡点上形成沉淀带。此法目前很少应用。

3.双向单扩散试验（simnle diffusion in twodimension）本法也称辐射扩散（radial innumodiffusion）。试验在平皿或玻璃板上进行，用1.6%～2.0%琼脂加一定浓度的等量抗血清制成厚度为2～3mm的凝胶板，于凝胶板上打直径为2mm孔，孔内滴加抗原液。抗原在孔内向四周辐射扩散，与凝胶中的抗体接触形成白环。白环随扩散时间而增大，直至平衡为止。沉淀环面积与抗原浓度成正比。因此可用已知浓度的抗原制成标准曲线，即可用以测定抗原的量。

此法在兽医传染病方面已用于马立克氏病的诊断，将马立克氏病的高免血清制成血清琼脂平板，拔取病鸡新换的羽毛数根，将毛根剪下，插于血清平板上，阳性者毛囊中病毒抗原向四周扩散，形成白色沉淀环。

4.双向双扩散试验（double diffusion in two dimension）双向双扩散试验是由Elek和Ouchterlony于1948年在同一时期分别建立的，习惯上也称为Ouchterlony法。这是一种目前在诊断实验室中最为常用的血清试验。一般所称的琼脂扩散试验即指本方法。

双向双扩散试验其特点与单向单扩散试验基本相同，但操作更为简便易行，是目前基层临床应用较多的实验方法之一。也可用于抗原与抗体的定量分析。

试验在平皿或玻璃板上进行。琼脂的最终浓度为0.8%～1.0%。琼脂凝胶厚度为2～3mm。在凝胶中打直径为2～5mm的孔，一般中间为1孔，周围为5～7个类似的孔，在中间孔内滴加抗原液（或抗体液），相应地在周围孔内滴加抗体液（或抗原液）。抗原与抗体从小孔向四周扩散，在比例适当处结合，形成肉眼可见的白色沉淀线。

进行定量试验时，通常是固定抗血清浓度，稀释抗原。先测定已知浓度的抗原形成的沉淀环的大小，并画出标准曲线，再测定待沉抗原形成的沉淀环大小，与标准曲线比较，即可计算出待抗原的浓度或含量。

（1）琼脂凝胶板的选择：试验用板或平皿可以是玻璃制品，也可是塑料制品，无论用何种制品，均应无色透明，表面平整光滑，厚度均一。玻璃制品经久耐用，表面不易划痕或损伤，但不易附着琼脂凝胶；塑料制品与琼脂凝胶的粘附性好，但不耐用。实验室可根据自己的情况选用。试验用板或平皿在制备琼脂凝胶板之前应充分洗净。

（2）琼脂凝胶制备：试验中常用优质琼脂或琼脂糖制备琼脂凝胶。用pH7.0～7.2 0.06mol/L PBS加入最终浓度为0.8%～1.0%的琼脂或琼脂糖。为防腐需要，可加入最终浓度为0.01%的叠氮钠或硫柳汞，于121℃高压灭菌5min使琼脂溶化，然后置2℃～5℃保存备用。临用前在水浴中溶化。

（3）制板：琼脂凝胶板的制备目前主要有两种方法，即单层法和双层法。由于玻璃制品不易附着琼脂凝胶，因此用双层法较为满意；而塑料制品易附着琼脂凝胶，用单层法即可取得满意效果。

单层法：在板上浇一层2～3mm厚的试验用琼脂凝胶即可。

双层法之一：首先在玻璃板上制一层厚度为1mm的2%琼脂凝胶，待冷凝后再在其上铺一层厚度为2～3mm的试验用琼脂凝胶。打孔仅在上层。

双层法之二：先在板上铺一层不含任何盐分的0.5%的琼脂凝胶，厚度以0.5～1mm为宜。待冷凝后阴干或于80℃～90℃烘干，然后再在其上浇一层厚度为2～3mm的试验用琼脂凝胶。

（4）打孔、加样与扩散：琼扩试验的打孔模型有许多种。在检疫中常用的是以正六边形状为基本模型。也可根据检验需要制成40孔型等。

试验中，各孔的孔径一般为3～5mm，中央孔和周边孔边缘之间的距离为2～5mm，加样时以所加样的液面与凝胶平面齐平为准。

加样完毕后，将板置于密闭湿盒内于37℃扩散24～72h，然后判定结果。

（5）结果判定和分析：在单一反应体系中（即仅有一个抗原孔和一个抗体孔，抗原和抗体可以是混合物），从理论而言，不同抗原与其相应的抗体反应的抗体反应形成各自的沉淀线，沉淀线在两个反应物孔之间。就一对抗原抗体而言，若两者浓度相当，则沉淀线位于两反应物孔的中间；若两者浓度相差较大，则沉淀线将移向低浓度一方。若某一对抗原抗体的扩散系数相同，则沉淀线呈直线状；否则沉淀线呈弧形，并弯向扩散系数小的一方。

在多反应体系中（即有多个抗原孔和抗体孔）沉淀线除具有单一反应体系的特点外，相邻孔形成的沉淀线之间可出现干扰、抑制、偏离和融合等情况，以此可判断出两个相邻孔中的反应物的关系。

具体而言，用于检测或比较抗原差异时，则将抗血清滴加于中心孔，待检和需比较的抗原滴入周围相邻孔。若出现的沉淀线完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，并有叉角，表明二者有共同抗原决定簇；若二者沉淀线互相交叉，说明二者完全不同。用以检测抗血清效价时，中心孔加抗原，抗血清倍比稀释后，置周围孔，出现沉淀线的血清最高稀释倍数，即为琼扩效价。用作血清流行病学调查时，将标准抗原置中心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别滴加待检血清，待检孔与阳性孔出现沉淀线完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀线或所出沉淀线与阳性对照的沉淀线交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀线，但两侧阳性孔的沉淀线在接近待检孔时，两端均向内弯曲者可判为弱阳性，若仅一条线弯曲，另一条仍为直线者判为疑似，需重检。重检时可加大检样的量。检样孔无沉淀线，但两侧阳性孔的沉淀线在接近检样孔时变模糊、消失。可能是待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀线溶解，可将样品稀释后重检。

（二）影响琼脂扩散试验结果的因素

1.电介质　抗原抗体反应有两个阶段，反应的第二阶段通常需要有电介质存在。电介质能降低抗体复合物表面的阴电荷，可促使沉淀。但电介质浓度太高或太低都会影响试验结果。最常用的电介质是氯化钠溶液、Tris－HCl缓冲液、巴比妥PBS等。

2. pH值　大多数抗原抗体反应的最适pH值为6～8。当反应的pH值接近蛋白质（抗原或抗体）的等电点时，会造成抗原或抗体的自凝或非特异性凝集或沉淀，从而影响其正常扩散。

3.琼脂的浓度　大多数抗原抗体反应的最适琼脂的浓度为1%，不同的抗原抗体不同，如禽流感病毒为0.6%。

4.温度　反应时的温度直接关系到反应速度。湿度过小造成琼脂凝胶中的水分蒸发，使凝胶干枯甚至干裂，造成凝胶体积缩小，密度加大，影响扩散。如果湿度过大，使水蒸气在盒盖上凝成水滴，掉在琼脂板上或抗原、抗体孔内，同样会影响试验结果，但究竟以多大湿度为宜，由于数据欠缺，因此需要在实践中摸索掌握。

二、环状沉淀试验

环状沉淀试验是快速检测可溶性抗原或抗体的方法。先将已知的抗血清加入小口径的试管内，然后小心加入待检抗原于抗血清的表面，经数分钟后在抗原抗体相接触的界面可出现清晰的白色环状沉淀带。该法以其简单、快速而得到广泛应用。如炭疽病的诊断（Ascoli反应）、链球菌血清型鉴定和沉淀素效价滴定等。

试验方法是取小口径（5mm×50mm）5只置于试管架上并标记号码。第一、二管内加抗血清，三、四管内加正常血清，第五管内加已知抗原，各管分别用毛细滴管加至4～5mm高。取1、4、5在其液面上轻轻叠加等量缓冲液，第二、三管的液面上轻轻叠加等量待检抗原。为防止破坏上下两液面，可将小试管微倾斜，沿管壁加入抗原或缓冲液。经数分钟后判定结果，第二管出现白色环状沉淀带，其余第一、三、四、五管无环状沉淀带判为阳性。

测定沉淀素效价时，需将抗原作100×、1000×、2000×、4000×、8000×、16000×等稀释，分别叠加于抗血清上，出现环状沉淀的最大稀释倍数，即该血清的沉淀素效价。

为防止影响结果的观察，试验用的反应液必须十分澄清。必要时可将反应液经60000r/min离心30min使之澄清。脂类的去除需在0℃下25000r／min离心30min，则脂类呈固态浮于表面，此时将离心管置冰浴中，用预冷的吸管或注射器插入底层吸出清朗的液体。

三、絮状沉淀试验

抗原与抗血清在试管内混合，在有电解质存在时，抗原抗体复合物可形成混浊沉淀或絮状凝聚物。通常用固定抗体稀释抗原法或固定抗原稀释抗体法，以检测抗原抗体的最适比例。抗原抗体在小试管内按不同比例混合后，置37℃水浴，每隔一定时间观察一次，记录出现反应的时间和出现絮状物的数量。出现反应最快和絮状物最高的管，即为最适比例。所测得的单位称为絮状单位。本法常用于毒素、类毒素和抗毒素的定量测定。