自生固氮菌的固氮能力及其对春小麦生长发育的影响

自生固氮菌的固氮能力及其对春小麦生长发育的影响

卢秉林　王文丽　李娟　郭天文

（甘肃省农科院土壤肥料与节水农业研究所　甘肃兰州　730007）

摘要：为挑选具有高固氮能力的自生固氮菌菌株，用乙炔还原法对甘肃省春小麦和玉米等非豆科作物根际土壤中分离所得的13株菌进行固氮酶活性测定，并通过盆栽试验对其进行春小麦肥效试验。结果表明：供试13株自生固氮菌对春小麦籽粒、生物产量及其构成因素均有一定促进作用，N6、N10、N13、N14、N27和N42 6株菌对春小麦产量的促进作用相对较高，具有一定的应用前景，有望成为微生物肥料研制的菌种。其中N13对春小麦的增产效果最为明显，与施同量肥料（1/3N）的对照相比，籽粒增产66.04%，生物产量增产54.19%，穗重增加47.65%，穗粒数增多37.91%，千粒重增加20.42%，株高增加5.16%，穗长增加21.89%，且具有较强的固氮能力，每盆固氮量为212.55 mg，固氮酶活性也显著高于其他菌株，达到139.79 nmol（C₂H₄）·h^-1·mL^-1。

关键词：固氮酶活性；自生固氮菌；春小麦；产量；固氮量

近年来，化肥尤其是氮肥的大量施用，在满足作物高产需求的同时，带来的肥料效应和化肥利用率下降、环境污染加剧等负效应已不容忽视^[1，2]。而施用微生物肥料，在提高作物生物固氮能力，发挥土壤潜在肥力，改良土壤质量，刺激和调控植物生长，增强植物抗病、抗逆能力，改善农作物品质，降低环境污染和提高作物产量等方面具有重要意义。各国的科学家们越来越重视微生物肥料的研发，特别是生物固氮的研究。但目前用于制备微生物肥料的菌种存活性弱，有效期短，对土壤环境要求比较苛刻，故筛选开发新型高效固氮菌株十分重要。本文通过对甘肃省春小麦和玉米等非豆科作物根际土壤中分离所得的13株菌进行固氮酶活性测定，并通过盆栽试验对其进行春小麦肥效试验，试图分离得到具有高固氮能力的菌株，以便为固氮菌肥的研制提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　供试菌株

注:本发表于《中国生态农业学报》，2009，17（5）:895～899.

供试菌株从甘肃省春小麦和玉米等非豆科作物根际土壤分离所得，并能在阿须贝培养基上良好生长，其编号分别为N6（芹菜根际）、N7（春小麦根际）、N8（芹菜根际）、N10（芹菜根际）、N13（春小麦根际）、N14（油葵根际）、N15（油葵根际）、N23（玉米根际）、N24（春小麦根际）、N25（芹菜根际）、N27（春小麦根际）、N38（春小麦根际）和N42（春小麦根际）。

1.2　菌株的固氮酶活性测定

固氮酶活性采用乙炔还原法测定:将菌种分别接种于盛有4.5ml改良阿须贝无氮培养基的试管（15mm×150mm）中，28℃下培养48h后，将试管的棉塞在无菌条件下换成橡皮塞，用无菌注射器从每支试管中抽出1.8ml气体，注入1.6mlC₂H₂，再置培养箱中培养48h后，从试管中抽取混合气体0.5ml注入气相色谱仪中，测定C₂H₂、C₂H₄的生成情况。从气相色谱仪显示屏的C₂H₄峰值判断有无C₂H₄的产生，以接种但未注入C₂H₂的试管作为对照，5次重复。根据公式（1）计算固氮酶活性。

N=（hx×C×V）/（hs×常数×t）（1）

式中，hx为样品峰值；hs为标准C₂H₄峰值；C为标准C₂H₄浓度（nmol·m l^-1）；V为试管体积（ml），常数为标准C₂H₄在测试时的体积（ml）；t为样品培养时间（h）；N为产生的C₂H₄浓度[即固氮酶活性，nmol（C₂H₄）·h^-1·ml^-1]。

1.3　菌株对春小麦的肥料效应及固氮量测定

试验设在甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所温室，采用盆栽试验，供试作物品种为春小麦“533-1”。盆栽土壤取自甘肃省农业科学院兰州试验站，取耕层0～20cm土层土壤，除去砾石及杂草枯枝后，混匀过筛。土壤肥力偏低，全氮0.24g/kg，全磷0.56g/kg，全钾24.9g/kg，速效氮18.2mg/kg，速效磷（P₂O₅）15.1mg/kg，速效钾（K₂O）41.0mg/kg，有机质2.29g/kg，全盐0.43g/kg，pH值为8.28。试验盆钵采用230 mm×200 mm的塑料花盆，每盆装土3.50 kg。肥料作为基肥一次性施入，播种前称取土样3.50 kg与肥料充分混匀后装盆，施肥全量按氮肥（N）0.15g/kg和磷肥（P₂O₅）0.1g/kg的常规用量计算，以盆为单位进行施肥。播种时每盆浇水700m l，出苗后保证作物有充足的水分供应。每盆播种12粒，出苗后第5d定苗7株。试验期间无异常气候现象，人工除草、病虫害防治同大田。

试验共设3个对照处理，13个接菌处理，5次重复，共80盆。CK₁处理不施肥（0N），CK₂处理施硝酸铵0.500g/盆、磷酸二氢钾0.670g/盆（1/3N），CK₃处理施硝酸铵1.500g/盆、磷酸二氢钾0.670g/盆（N）；其余处理为13株供试菌株的接菌处理，接菌处理施肥量为硝酸铵0.500g/盆，磷酸二氢钾0.670g/盆（1/3N），在苗期和分蘖期每株小麦接种相应菌液1ml。春小麦于2007年4月4日播种，7月16日收获，收获时各盆单打单收，进行常规考种；采用H₂SO₄-H₂O₂消煮，奈氏比色法对秸秆和籽粒中全氮含量进行测定，计算固氮量，其中固氮量为同等施肥水平下，接种处理地上部分（秸秆+籽粒）全氮总和与不接种处理地上部分全氮总和之差。

1.4　数据处理

试验数据采用Excel 2003和DPS 3.01软件进行统计分析。

图1　不同自生固氮菌的固氮酶活性

图2　不同自生固氮菌对春小麦籽粒产量和生物产量的影响

2　结果与分析

2.1　不同自生固氮菌的固氮酶活性

（图1）表明13株自生固氮菌的固氮酶活性介于41.55～139.79 nmol（C₂H₄）·h^-1·ml^-1，其N13＞N6＞N27＞N10＞N24＞N25＞N23＞ N7＞N8＞N14＞N15＞N38＞N42，N13菌株的固氮酶活性达139.79nmol（C₂H₄）·h^-1·ml^-1，显著高于其他菌株。

2.2　不同自生固氮菌对春小麦产量及产量构成因素的影响

2.2.1　籽粒产量和生物产量

从图2可以看出，供试13株自生固氮菌中，N6、N7、N8、N10、N13、N14、N15、N27和N42 9个接菌处理的春小麦籽粒和生物产量均显著高于CK2对照，其中N6、N10、N13、N14和N27 5株菌对春小麦籽粒和生物产量的增产幅度相对较高，相比CK₂对照的增产幅度均超过25%，而N42虽然对春小麦生物产量的增幅只有22.87%，但对春小麦籽粒产量的增幅却达到30.18%。接菌处理中N13对春小麦籽粒和生物产量的增产效果均为最高，分别比CK₂对照增高66.04%和54.19%，但却低于施全量肥料的CK₃对照，且差异显著。

2.2.2　产量构成因素

由（表1）可知，各接菌处理的春小麦穗粒数均高于施同量肥料的CK₂对照，其中N6、N7、N8、N10、N13、N14、N15、N27和N42 9个接菌处理的春小麦穗粒数与CK₂差异达显著水平，N13和N42接种处理的春小麦穗粒数相对较多，为37.43粒和37.34粒，比CK₁和CK₂对照分别增长615.68%、37.91%和613.96%、37.58%，且与CK₃对照无显著差异。从春小麦千粒重看，尽管N8和N42接种处理的春小麦千粒重低于CK₂对照，但差异不显著，其余接菌处理的春小麦千粒重均高于CK₂对照，其中N10、N13、N25和N27接菌处理的春小麦千粒重与CK₂对照差异达显著水平，而N13接菌处理的春小麦千粒重在接种处理中最高，与CK₃对照差异不显著。从春小麦穗重看，13个接种处理中，除N23、N24、N25和N38 4个接种处理的小麦穗重与CK₂对照无显著差异外，其余处理的小麦穗重均显著高于CK₂，但却显著低于CK₃，且N13接菌处理的春小麦穗重同样在所有接种处理中最高，平均穗重为2.20 g，比CK₁和CK₂对照分别增长566.67%和47.65%。从小麦秸秆重看，各接菌处理的春小麦秸秆都显著重于CK₁，又显著低于CK₃，除N7、N23、N24、N25和N42接菌处理的小麦秸秆重与CK₂处理差异不显著外，其他接菌处理都显著高于CK₂，其中N10和N13接种处理的小麦秸秆重显著高于其他接菌处理，平均每盆重7.28 g和7.96 g，分别比CK₁和CK₂对照增长215.15%、52.62%和244.59%、66.88%。有9个接种处理的小麦株高高于CK₂对照，其中N6、N13、N14和N27接种处理的小麦株高相对较高，分别高于CK₂4.04%、5.16%、4.51%和4.51%。同样有9个接种处理的麦穗长于CK₂对照，其中N13接种处理的麦穗最长，显著高于其他接种处理，且与CK₃对照差异不显著。

表1　不同自生固氮菌对春小麦产量构成因素的影响

表2　不同自生固氮菌对春小麦的固氮作用

2.3　不同自生固氮菌在春小麦上的固氮作用

固氮量测定可用全氮增加来衡量，在无化合态氮来源的情况下，若系统中全氮量有净增加则表明有固氮作用发生，比较固氮系统和不固氮系统中全氮量，以确定固氮量。由（表2）可知，所有接菌处理的春小麦，无论是秸秆还是籽粒，其全氮量相比CK₂对照均有所增加，说明供试的13株自生固氮菌均能固定空气中的氮素供春小麦吸收，同时也能提高春小麦籽粒和秸秆吸收氮素的能力。N6、N10、N13、N27和N425株菌的固氮量相对较高，超过100.00mg/ pot，其中N13菌株的固氮能力最强，每盆达212.55 mg。

3　结论与讨论

从非豆科作物根际土壤分离所得13株菌的固氮酶活性为41.55～139.79 nmol（C₂H₄）·h^-1·ml^-1，其中N6、N7、N10、N13、N23、N24、N25和N27 8株菌的固氮酶活性超过50 nmol（C₂H₄）·h^-1·ml^-1，该结果与春小麦固氮量的多少并不完全一致，其中只有N6、N10、N13和N27 4株菌具有相对较高的固氮量，超过100.00mg/pot，这主要是因为固氮酶活性测定方法的局限性所致，因为能还原乙炔的菌株并不一定能固氮。同时，固氮量超过100.00mg·pot^-1的还有N42接菌处理，而其固氮酶活性却不高，只有41.55nmol（C₂H₄）·h^-1·mL^-1，这可能是因为该菌株对春小麦生长发育的促进作用并不是只有菌株固氮一个因素，而是多种因素的综合，从而使N42接菌处理的春小麦具有很高的籽粒和生物产量，相应固定了较多氮。有关这方面已有报道。

试验结果表明，从不同作物根际分离所得的13株自生固氮菌对春小麦籽粒、生物产量及其构成因素均有一定的促进作用，说明自生固氮菌与作物之间无依存关系，虽然它们分离于不同的作物根际土壤，但均可以固定空气中的氮，供给春小麦吸收利用。N6、N10、N13、N14、N27和N42 6株菌对春小麦产量的促进作用相对较高，其中N13对春小麦的增产效果最为明显，与施同量肥料（1/3N）的CK2对照相比，籽粒增产66.04%，生物产量增产54.19%，穗重增加47.65%，穗粒数增多37.91%，千粒重增加20.42%，株高增加5.16%，穗长增加21.89%，同样该菌株具有最高的固氮量和最大的固氮酶活性。这一研究结果进一步验证了曹云海关于固氮菌可以有效增加小麦、玉米产量的结论。Gaskins的研究结果表明固氮菌能有效积累氮素；而林代炎等的盆栽试验表明，在一定施肥水平基础上，接种固氮菌对水稻有增产趋势，但效果不明显，这可能是因为供试菌种的固氮能力大小或其要求的最佳固氮环境与供试环境不完全一致所致。

综合13株菌对春小麦籽粒产量、生物产量和构成因素，及其固氮酶活性和对春小麦固氮量的影响认为:供试13株自生固氮菌中，N6、N10、N13、N14、N27和N42 6株对春小麦产量的促进作用相对较高，具有一定的应用前景，有望成为微生物肥料研制的菌种，值得继续研究和开发。其中N13对春小麦的增产效果最为明显，但是与1/3氮肥配合施用的效果不及施全氮处理，到底与多少量的氮肥配合施用效果最佳，需要进一步试验。此外，由于盆栽试验的局限性和乙炔还原法本身的一些限制因素，本文对试验菌株的固氮特性只是一个初步试验，如在实际生产中推广应用还有待进一步研究。