任务5.1常用基本技术

任务5.1　常用基本技术

在微生物的分离、纯化及保藏操作中，经常用到无菌操作、接种及培养等基本技术。现简单介绍如下：

5.1.1　无菌操作技术

自然环境中微生物无处不在，在接种分离操作中，用于防止微生物进入无菌范围的操作技术称为无菌操作技术。微生物研究工作是以微生物的纯培养作为基本材料，所以必须采用无菌操作，它是保证微生物学研究正常进行的关键。如果无菌操作不严，引起杂菌污染，不但造成菌种混杂，实验结果不准确，而且还会给实际生产带来严重损失，所以接种特别强调无菌操作。其目的主要在于保证供试菌不受其他微生物的污染。为此，实验人员必须加强“无菌”、“安全”的观念。

接种时的无菌操作，如斜面转接斜面，斜面转接平板等，因接种内容和形式不同，在操作上有一定的差异，但基本程序，特别是无菌要求是一致的。无菌操作技术要点是：在无菌操作箱或无菌操作室内、火焰附近进行熟练的无菌操作（图5.1）。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药物灭菌，无菌室通无菌空气维持无菌状态，酒精灯火焰周围约10cm范围内是无菌的。无菌操作要求主要有以下几点：

①执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。

②进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。

③在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。菌种所暴露或通过的空间，必须是无菌区域。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌包一经打开应尽早使用。凡已取出的无菌物品，虽未使用也不可再放回无菌容器。

④一切微生物的分离、接种操作均需在无菌室或超净台内进行，所有器具必须经过严格灭菌后方可使用。还须注意经灼烧灭菌的接种工具，须靠在管（瓶）内壁冷却片刻，不要用未经冷却的工具取菌，所取菌种也不得在火焰旁停留，以免灼伤菌种。

⑤操作过程中严禁来回走动和交谈，以免引起灰尘或微生物孢子扩散污染。

⑥每次操作完毕，应及时清理干净，将用过的器具放回原处，废弃用过的东西带出室外，并经过灭菌处理。

⑦经常保持实验场所和器具的整洁，不得带入非必需物品。

⑧每次操作时间不宜太长，避免无菌箱（室）内因空气交换而增多杂菌。

图5.1　无菌操作技术

5.1.2　接种技术

1）一般用品

①酒精灯：主要用于对接种工具进行灼烧灭菌，以及试管、菌种管、三角瓶、培养皿等常用玻璃器皿的火焰封口，棉塞的过火灭菌等。

②75%酒精：用于双手和母种试管外表的擦抹消毒，以及一些不适宜高温或干燥灭菌的物品等。

③培养皿或烧杯：用于放置废弃酒精棉球等杂物。

2）接种工具

接种时需要工具，常见的有接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角形接种棒，具体形式如下图（图5.2）。

图5.2　常用微生物接种工具

a.接种环；b.玻璃刮铲

1.塑料套；2.铝柄；3.镍铬丝；4.接种针；5.接种钩；6.接种环；7.接种圈；8.接种锄；9.三角形辞铲；10.平刮铲；11.移液管；12.滴管

①三角形接种棒（涂布棒）：用直径2～3mm玻璃棒在喷灯上烧红，用镊子加工成型，用来进行平板表面涂布操作。也有些制作成“L”形的涂布棒，做法与三角形接种棒相同。

②滴管和移液管：用来转移液态培养液。

③接种环：接种环和接种针是最常用的接种工具，它们的使用是微生物学实验最基本的技能之一。接种环由金属丝和柄两部分组成。金属丝的软硬要合适，传热和散热要快。目前我国主要用镍铬丝代替，或者也可由600～1000W的电炉丝代替，按照需要制成直径3～4mm的圆圈，位于末端，中央要圆而不带棱角。柄的部分常用铝棒或铜棒制成。前端有一连接金属丝的螺旋卡头，后端有一不传热的胶木柄。亦可取长20～22cm的一段塑胶铝芯电线，铝芯直径约2mm，在一端留下6～8cm的塑胶套，其余塑胶套全剥去，露出铝芯，将铝芯前端约5mm的一段从正中劈开，夹入一段6～8cm长的镍铬丝（即600～1000 W的电炉丝），将铝芯敲紧封严，并将镍铬丝制成圆圈即成。接种环主要用于划线分离、纯种移种及涂片等操作。

④接种针：也是由金属丝和柄两部分组成。直接将镍铬丝与柄连接即为接种针，针要求直，不要弯曲。接种针主要用于穿刺接种及菌落的挑选。

⑤接种钩：组成同接种针和接种环。将镍铬丝末端弯出2～3mm成直角即为接种钩。用于选取平板上微小菌落并移植到斜面培养基上，因与平板接触面积小，故不易混杂。

3）接种设备

接种必须在严格的无菌条件下进行。因此，首先要有能创造无菌区域的主要设备。最常用的有无菌室，其次为超净工作台。可根据生产规模、资金条件和接种对象，选用或建造适宜的设备。

（1）无菌室

无菌室又叫接种室或接菌室，一般设在灭菌室和培养室之间。如在较大的实验室内，可将无菌室设在实验室一角，用适当的材料围砌（如砖、木板、纤维板等），与外围空间隔绝，防止空气流动，以形成无菌空间。具体要求如下：

①应隔成里外两间，里间为接种室，外间为缓冲室。两室均应有天花板，以形成密闭空间。如能设置2个缓冲室，则使用效果更好。

②缓冲室的作用主要是减少外界空气直接进入接种室，因此，缓冲室和接种室的门应错开方向，且应采用左右移门，以减少空气的流动。另外，门应设在远离工作台的地方，以免影响接种操作。

③接种室须设两个通气窗，均应开在远离操作台的地方。可以在接种室移门上方的天花板上开一个，另一个开在对角的墙角，离地面20cm高处。两窗口要覆盖八层纱布，并装有可密封的移动窗门，以便平常和熏蒸灭菌时关闭，接种时再移开，保证空气流通。

④最好在缓冲室和接种室各安装一支紫外线灯和日光灯，两灯并排在缓冲室中部上方，以及接种室操作台上方。接种室内如能安两支紫外线灯则更好。

⑤缓冲室内应备有专用的工作服（挂在墙上）、鞋帽和口罩，盛有皮肤消毒剂（如2%来苏儿）的脸盆和毛巾，以及供喷洒消毒用的喷雾器和消毒剂（如2%～3%来苏儿或5%漂白粉溶液）等。接种室内应备有接种所需的各种器械。

（2）超净工作台

超净工作台是微生物实验室普遍使用的无菌操作台。在操作区内，其洁净度可达100级。超净工作台适用于普遍微生物接种、检验等操作。对于一些传染性较强的微生物及真菌的操作，最好使用生物安全净化工作台，因其有特别配置的一套空气回收系统，可以避免污染环境，并保护操作者不受有害危险微生物的侵害。

超净工作台通常采用封闭式结构、过滤式除菌，不用化学药剂灭菌和火焰封口，避免了环境污染，改善了操作条件，降低了劳动强度，保障了人员健康。它无菌程度高，又避免了酒精灯产生的高温，因此也提高了接种成品率。凡有条件的单位，选用这种先进的接种设备，可大为提高接种工序的效率。

超净工作台在使用时要注意以下几点：

①超净工作台应安放在洁净度较高的室内，必须不受外界风力影响。

②操作工程中用到的物品要整齐地摆放在工作台内。

③使用前要挽起衣袖，手臂消毒后方可伸入工作台进行操作，严禁将衣袖同时伸入工作台。使用过程中，禁止在工作台内外传递物品。

④操作时，应保持操作区附近安静，禁止搔头、快步走动等，以免造成污染。

⑤安放净化台的房间，严禁蒸汽消毒。

4）接种方法

在无菌条件下，用接种环或接种针等把微生物转移到培养基或其他基质的过程称为移植或接种（inoculation），这是生物科学研究中最重要的基本操作。根据移植操作的粗放程度，可将其分为以下两类：一类是在开放或半开放条件下进行的移植操作，称为播种或点种。另一类是在严格的无菌条件下进行的移植操作，称为接种。

接种是微生物实验及研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态、生理的实验及观察研究都必须进行接种。在无菌条件下的接种，是将所需的菌种移接到经过严格灭菌的培养基中，只允许移接的菌种在其中生长，不允许其他任何微生物混杂其中。在微生物研究和应用中常用的接种方法有以下几种：

①划线接种：这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面拖动接种环作来回直线形的移动。常用的接种工具有接种环、接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。

②穿刺接种：在保藏厌氧菌种或研究微生物的运动能力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针，用的培养基一般是半固体培养基。具体操作是：用接种针沾取少量的菌种，于半固体培养基的中心向下垂直刺入，直至离管底约5mm，接种针再沿原路退出。如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长（图5.3）。

图5.3　穿刺接种示意图

③三点接种：在研究霉菌形态时常用此法。此法即用灭菌的接种环挑取少量微生物菌种以呈等边三角形的三点点植于固体培养基平板表面上，让其各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也可进行一点或多点接种。

④涂布接种：与混烧接种略有不同，就是将固体培养基注入平皿，让其凝固，然后再将菌液加至平板表面，迅速用三角形接种棒（即涂布棒）在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，经适宜温度培养后就可长出单个的微生物菌落。

⑤混烧接种：该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45～50℃左右的固体培养基，迅速以画“8”字的方式轻轻摇匀，这样可以达到稀释菌液的目的。待培养基凝固后，置合适温度下培养，就可长出单个微生物菌落。

⑥液体接种：从固体培养基表面刮取菌落或菌苔，接入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液移至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

⑦注射接种：该法是用注射的方法将待接的微生物转移至获得生物体内，如人或其他动物体内。常见的疫苗预防接种，就是用注射接种。将疫苗接入人体，来预防某些疾病。

⑧活体接种：活体接种是专门用于培养病毒或其他病原微生物的一种方法。因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物，也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。

5.1.3　培养技术

微生物的培养是一个复杂的技术。培养微生物时，应根据微生物的种类和目的等选择适宜的温度、湿度、时间、pH值，尤其是对O₂与CO₂的需要情况等环境条件。注意，由于微生物无处不在，从制备培养基时开始，整个培养过程必须按无菌操作要求进行，否则外界微生物污染标本，会导致错误结果，而培养的致病菌一旦污染环境，就会引起交叉感染。

1）培养方法

微生物的培养方法，按其不同的呼吸类型，主要分为好气培养法和厌气培养法两种。

（1）好气培养法

大多数细菌、放线菌、霉菌以及藻类等都是好气性微生物，需要从空气中获得氧气进行有氧呼吸。通常采用的有以下几种

①固体培养：把微生物培养在固体培养基的表面，如斜面培养或平板培养等。

②液体培养：将微生物菌种接种到液体培养基中进行培养。具体方法又可分为三种：

a.静置培养：接种后培养的液体静置不动。一般采用浅层培养。

b.振荡培养：接种后利用摇床进行振荡培养，使通气良好，增加液体培养基中的溶解氧。

c.深层培养：此法是一种大规模工业生产的培养方法，多用大型发酵容器进行培养。

（2）厌气培养法

有些厌气性微生物如梭菌和产甲烷细菌等，其细胞具有脱氢酶系，缺乏氧化酶系，只能在没有游离氧存在的条件下繁殖，而在有氧条件下很难生长，甚至死亡。厌气培养方法可采用以下几种：

①高层琼脂柱：把经灭菌的琼脂培养基在无菌操作下装入试管内，高度达到试管的2/3，形成深柱，接种时采用穿刺接种至琼脂底部，使厌气菌在琼脂底部生长。

②凡士林隔绝空气：培养基灭菌后在沸水中煮沸5min，排除培养基内的氧气，再用少许无菌的融化凡士林，放在培养基表面，冷却后即可使培养基与空气隔绝。

③CO₂培养法：是将某些微生物，如脑膜炎球菌、布鲁杆菌，在产生CO₂的环境中进行培养。常用的产生CO₂的方法有烛缸法、化学法和CO₂培养箱。

2）微生物生长情况

经过适宜条件的培养，微生物会在培养基表面或内部生长繁殖而出现某些现象。微生物种类不同，培养基不同，其生长情况就有所不同。下面以细菌为例，介绍其生长情况：

（1）液体培养基中生长情况

大部分细菌在澄清的液体培养基中生长后，培养液呈现均匀浑浊；有的细菌如炭疽杆菌及链球菌生长呈沉淀，细菌沉于管底，培养液并不浑浊；有的细菌如枯草杆菌、结核杆菌等则在液体表面生长形成菌膜，培养液仍较澄清。这些现象均有助于细菌的鉴别。

（2）半固体培养基中生长情况

半固体培养基琼脂含量少，黏度低，细菌在其中仍可自由运动。用接种针将细菌穿刺接种于半固体培养基中，如该菌有鞭毛，能运动，则细菌由穿刺线向四周游动扩散，培养后细菌沿穿刺线呈羽毛状或云雾状浑浊生长，穿刺线模糊不清；如细菌无鞭毛，不能运动，则穿刺线明显，细菌沿穿刺线呈线状生长，周围培养基仍然透明澄清。因此，半固体培养基可用来检查细菌的运动能力。

（3）琼脂平板中生长情况

观察细菌的菌落，从菌落的大小（直径2～3mm为中等大小）、形状（圆形或不规则）、颜色（水溶液色素或脂溶性色素）、表面情况（光滑或粗糙）、边缘（完整、锯齿状、裂片状或不规则）、透明度（透明、不透明或半透明）、隆起程度（低凸、平凸、凹下）、湿度（湿润或干燥）、质地（较硬或较软）、溶血性（菌落周围有无溶血环，是完全溶血环还是不完全溶血环）等方面对菌落进行菌落形态特征的描述。

另外，固体培养基应注意湿度问题。新鲜配制固体培养基，其湿度均适宜微生物的生长；放置时间过长的固体培养基除易污染外，因水分蒸发导致琼脂偏干，则严重妨碍微生物的生长繁殖。污染或偏干的固体培养基不可使用。刚制备的斜面培养基或琼脂平板，因培养基的温度偏高，常使琼脂表面有冷凝水产生，导致细菌蔓延扩散生长，因此，接种前应消除表面凝集水，使湿度适当降低。半固体和液体培养基，没有湿度不妥的问题。

培养时间依实验目的不同而不同。增菌培养一般用6～18h，当出现微生物生长现象，例如有轻度混浊生长时即可；分离培养是18～24h，以长出特征菌落，可供挑取作为待检菌落，或可供计数；生化反应等鉴别试验，也多培养18～24h后观察结果。必要时，亦可延长培养时间。