应用超滤技术提取发菜多糖

应用超滤技术提取发菜多糖

应用超滤技术提取发菜多糖⁽¹⁾

林永贤　于海峰　曹伟铎　贾士儒

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：采用离心分离预处理、超滤提取工艺提取发菜多糖，工艺简单可行、产品纯度高。超滤操作条件为室温（25℃） ，操作压力0.04MPa，多糖可浓缩至5g · L^-1。所得多糖制品纯度达96%。

关键词：超滤；发菜；多糖

发菜（发状念珠藻，Nostoc flagelliform）是一种生长于荒漠—半荒漠地区的陆生蓝细菌，在我国主要分布于宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙古、河北等省区。研究发现发菜多糖对流感病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等多种具有封套的病毒有很强的抗病毒活性^[1]。发菜自然生长极为缓慢，对发菜的不合理采收导致发菜资源濒临枯竭，发菜生长地的生态环境遭到严重破坏。发菜细胞液体悬浮培养技术可以在不消耗野生发菜资源的前提下得到大量发菜细胞和培养液，并且能直接从培养液中提取发菜多糖。

与其他分泌胞外多糖的微生物不同，发菜细胞分泌的胞外多糖在培养液中含量很低，浓度仅为0.01%左右。超滤是一种新型的膜分离技术，将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离，具有不损害多糖活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优点。可以同时达到去除小分子，提高多糖浓度，大批量处理培养液等目的。本文采用内压式中空纤维膜超滤装置对发菜细胞培养液进行浓缩处理，简化了多糖的提取工序，节省了提取时间和乙醇用量。

1　材料与方法

1.1　材料发菜细胞培养液。

1.2　仪器内压式中空纤维膜超滤装置（天津膜天膜工程有限责任公司） 。

超滤实验装置如图1所示，膜组件主要性能如表所示。

1.培养液2.蠕动泵3.超滤组件4.透过液5.调压阀6.隔膜压力表

图1　超滤装置

表1　实验用膜组件主要性能

1.3　发菜多糖提取

对经过离心预处理的培养液进行超滤浓缩，当膜通量降低到一定数值后停止超滤，收集浓缩液，乙醇沉淀后冷冻干燥，得到发菜多糖粗品。

1.4　计算分析方法

多糖含量测定：苯酚-硫酸法^[2]

膜通量的测定： J=V/ （S*t）

式中J：膜通量（L · m^-2· h^-1） ； V：透过液体积（L） ； S：膜的有效面积（m²） ； t：超滤时间（h） 。

截留率的计算R=1-C_p/C_f

式中C_p：超滤液浓度（mg · L^-1） ； C_f：料液浓度（mg · L^-1） 。

2　结果与讨论

2.1　培养液预处理对膜通量的影响

结束培养后，发菜培养液静置沉淀24h，收集上清液。对比上清液经离心处理和未经离心处理对超滤通量的影响。超滤浓缩的料液必须是均一的溶液，如果含有不溶性的组分，会造成滤膜的堵塞，降低超滤效率。发菜培养液中存在一些不溶性大颗粒物质，悬浮在培养液中，静止沉淀不能很好地将它们除去。不溶性大颗粒物质的存在，使培养液变得浑浊，影响超滤效率，甚至多糖的纯度。对比经过离心处理和没有离心处理的上清液，在20℃，0.04MPa下的超滤浓缩情况。从图中可以发现，经离心处理的培养液的膜通量明显大于未经离心处理的培养液。未经离心处理的培养液超滤过程中通量的衰减也大于经离心处理的培养液。这表明，料液中的不溶性大颗粒物质堵塞了滤孔，造成滤膜污染，降低了膜的效率。因此，培养液中如果含有不溶性成分，静置除去细胞后的上清液超滤前的离心处理是非常必要的。

图2　预处理对膜通量的影响

2.2　不同操作压力的影响

图3　压力对膜通量的影响

温度20℃，测定操作压力为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12MPa下超滤开始时的膜通量，结果如图所示。增大操作压力可以提高超滤的通量。然而，压力增大的同时也会加速滤膜的浓差极化现象提早出现^[3，4]，使通量下降影响超滤效果，并且能耗大。实验中还发现随着压力的增加，系统压力的变化幅度也随着增加，使系统的稳定性降低，影响操作。因此，操作压力并不是越大越好。太低的操作压力膜通量太小，使操作时间延长。综合考虑，采用压力为0.04Mpa为操作的合适压力。

2.3　超滤温度的选择

图4　温度对膜通量及截留率的影响

分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，操作压力为0.02MPa的条件下，测定膜通量变化情况（图5） 。从图中可以看出，温度也是影响超滤通量的一个重要因素。温度越高，超滤通量越大。这是因为温度升高会使料液的粘度下降，扩散系数和传质系数增大，即溶质与水亲和力加大，减少浓差极化，降低了滤膜表面对大分子溶质的吸附现象。因此，膜通量在高温时较大。如果仅从增大膜通量考虑，应该是选择在高温操作较好。但是，在高温时可能会使膜截留性能改变，温度越高，大分子的通过率就相应的增加，降低截留率，增大了多糖的损失使得率下降。同时，提高温度增加操作工序，使能耗加大。综合考虑膜的性能，截留率以及能耗等因素，采用室温20～25℃作为超滤的最佳温度。

2.4　在确定条件下的超滤浓缩结果

综合以上各因素，室温25℃时，培养液离心处理后，在操作压力为0.04 MPa的条件下超滤浓缩。三批不同的培养液浓缩后的体积和多糖的损失见下表。

表2　超滤前后含量的变化

利用超滤法对培养液浓缩，体积缩小了将近100倍，极大的提高了多糖的含量。多糖损失为18%左右。可能由于一些多糖的分子量太小（≤20 000D）随超滤液被排放掉和一些多糖形成凝胶层吸附在滤膜上造成了损失。

2.5　乙醇沉淀条件的确定

乙醇沉淀法提取水溶性多糖，主要原理是通过降低水溶液的介电常数使多糖脱水从而产生沉淀来分离多糖。乙醇沉淀法有成本较低，易于回收，操作安全，适合大规模生产等优点，是提取多糖的一种最为常用的方法。取20ml浓缩液，加入乙醇，使溶液中乙醇的含量分别为50%，60%，70%，80%，90% （体积比） 。4℃静止放置24h，离心收集沉淀，冷冻干燥后称重。随着乙醇含量的增加，多糖得率也在增加。尤其从60%到70%多糖得率增加迅速，然后趋于缓和。虽然90%时多糖得率最高，但与80%时的多糖得率相差不大，考虑到提取成本，采取乙醇含量为80%作为提取的最佳条件，此时乙醇用量约为4倍浓缩液的体积。

图5　乙醇用量对多糖得率的影响

2.6　多糖浓度对乙醇沉淀的影响

在确定了乙醇含量80%时为醇沉的最佳条件后，考察不同多糖浓度对沉淀的影响。取多糖浓度分别为1，2，3，4，5g/l的超滤浓缩液，加入乙醇，使之含量为80%，收集沉淀冷冻干燥，计算得率。从图7可以看出，用80%的乙醇沉淀多糖得率均维持在一个较高的水平上（大于60%） 。多糖得率随着浓度的增大而提高。考虑到乙醇的用量，认为培养液浓缩至多糖含量为4～5g/l，较为合适。但是浓度不能太高，因为发菜多糖的粘度随浓度的增加而增大，为减少乙醇用量而一味的增大多糖浓度，会加大超滤系统的负担，造成不必要的损失。

图6　多糖浓度对多糖得率的影响

2.7　多糖含量的测定

称取10mg粗多糖，用水溶解后定容至100ml。采用苯酚硫酸法测定溶液中多糖的含量为9.6mg，即粗多糖的纯度为96%。

3　结论与展望

（1）对影响超滤性能的各因素作了研究，认为操作压力是影响超滤操作参数—膜通量的一个重要原因。采用0.04MPa作为超滤的最佳条件，缩短了操作时间，提高了工作效率。

（2）确定了乙醇沉淀提取多糖的最佳条件，即多糖浓度为4～5 g · L^-1，乙醇含量为80%。

（3）采用超滤浓缩，乙醇沉淀得到的发菜多糖具有较高的纯度，多糖含量达到了96%。

超滤是一种新型的膜分离技术，在工业废水处理，城市污水处理，食品和医药工业以及生物技术工业上都得到了广泛的应用^[5，6]。超滤技术在多糖提取方面的应用国内这几年也陆续有报道，并有不断增多的趋势^[7]。利用超滤浓缩技术处理发菜细胞培养液，是一个新的尝试。本文考察了超滤时间，温度，压力等因素对膜通量的影响。认为利用超滤技术浓缩提取发菜胞外多糖操作条件温和，处理量大，对料液的化学性质没有影响，适合工业化生产。

参考文献：

[1] Kenji Kanekiyo，Jung-Bum Lee，Kyoko Hayashi，Hiroyuki Takenaka，Yumiko Hayakawa，Shunro Endo，Toshimitsu Hayashi. Isolation of an Antiviral Polysaccharide Nostoflan from a Terrestrial Cyanobacterium Nostoc flagelliforme （J （.Journal ofNatural Products.2005，68 （7） :1037～1041

[2]白雪娟，苏建宇，赵树欣，贾士儒.发菜细胞培养液中多糖含量测定方法的比较研究[J[.食品工业科技. 2004，25 （11）:146～150

[3]A.拉什顿，A.S.沃德，R.G.霍尔迪奇著.朱企新，徐莉，谭蔚等译.固液两相过滤及分离技术[M].北京：化学工业出版社，2005

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[5]刘茉娥，等著.膜分离技术应用手册[M].北京：化学工业出版社，2001.

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[6]胡亚芹，曹杨.超滤膜技术在多糖提取方面的应用.生物技术通讯，2005，16 （2）:228～230

【注释】

(1)基金项目：国家自然科学基金（20376061）和天津市科技发展计划重点基金（043801611）