发状念珠藻多糖的提取精制

7．2．2　发状念珠藻多糖的提取精制

7．2．2．1　小分子杂质的去除

去除小分子杂质可以采用透析和超滤两种方法。当样液处理量较小时，一般采用透析的方法，透析前首先采用减压浓缩至小体积，过滤后装入透析袋（透析分子量8000～14000），以蒸馏水透析48小时除去小分子杂质。但透析袋的处理量有限，不适合大规模生物分离过程。大批量的多糖溶液则可采用超滤法，在浓缩多糖溶液的同时除去小分子杂质。

图7－2　培养液中多糖含量对膜通量的影响

7．2．2．2　除蛋白

三氯乙酸（TCA）法和Sevag法是常用的除蛋白方法。粗多糖溶液分别采用TCA法和Sevag法除蛋白，对两种方法进行比较。

（1）TCA法：在样液中加入等体积的3%～6%三氯乙酸，观察蛋白沉淀产生的情况，结果如表7－10，不同三氯乙酸浓度下均未观察到样液中有蛋白质的沉淀析出，原因可能是由于多糖溶液中蛋白质含量较低，故该法不适用于发状念珠藻细胞培养液中蛋白的去除。

表7－10　TCA法除蛋白结果

（2）Sevag法：采用Sevag法除蛋白的结果见表7－ 11及图7－2。样品经Sevag法除蛋白后，其280nm处吸光度值明显降低，并且可以观察到在水相和有机相之间有一层白色不溶性物质，即变性的蛋白质。所以，对于蛋白质含量较低的多糖样品采用Sevag法效果更好，但其除蛋白的效率不高，需要多重复几次。

表7－11　Sevag法除蛋白结果

图7－3　Sevag法除蛋白效果

7．2．2．3　有机溶剂沉淀多糖条件的确定

发状念珠藻多糖为水溶性多糖，具有溶于水而不溶于有机溶剂的性质。因此，发状念珠藻多糖可采用乙醇进行沉淀提取（醇析），其中醇析的温度、时间、乙醇用量等对发状念珠藻多糖的提取结果有较为显著的影响。

（1）乙醇加入量对多糖提取的影响：分别量取样液50ml于三角瓶中，加入不同体积倍数的95%乙醇溶液，使其体积比（乙醇∶样液）分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1。室温（约20℃）下醇析24小时。4000r· min^－1离心30分钟，沉淀冷冻干燥并称重。结果如图7－ 3所示。在乙醇与样液体积比小于5∶1时，多糖的析出量与乙醇的用量成正比，当乙醇用量进一步增加到样液体积的6倍时，所得多糖干重不再增加，表明溶液中的多糖已完全析出，因此，乙醇与样液体积比以5∶1为宜。

图7－4　乙醇用量对多糖提取的影响

（2）醇析时间对多糖提取的影响：分别量取样液50ml于三角瓶中，加入5倍体积95%乙醇溶液在室温（约20℃）下分别醇析12小时、24小时、36小时、48小时和60小时，4000r· min^－1离心30分钟，沉淀冷冻干燥并称重，结果如图7－4所示。当醇析时间为36小时时，多糖产量最高，此后析出多糖干重不再增加，表明多糖已完全沉淀出来，因此醇析时间控制在36小时为宜。

（3）醇析温度对多糖提取的影响：量取样液50ml于三角瓶中，加入5倍体积的95%乙醇溶液，分别在0℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃下醇析36小时。4000r· min^－1离心30分钟，沉淀冷冻干燥并称重，结果如图7－5。低温更有利于多糖的析出，0℃时的析出量最大，但考虑到操作的便利性，选择醇析温度为4℃为宜。

因此，采用95%乙醇沉淀发状念珠藻多糖时，适宜的操作条件应为：加入5倍体积的乙醇，在低温（4℃）下醇析36小时。

图7－5　醇析时间对多糖提取的影响

图7－6　醇析温度对多糖提取的影响

（4）多糖浓度对提取得率的影响：取多糖浓度分别为1g· L^－1、2g· L^－1、3g· L^－1、4g· L^－1、5g· L^－1的超滤浓缩液，乙醇沉淀，收集沉淀冷冻干燥，计算多糖得率的结果如图7－ 6。结果表明，多糖得率随着其浓度的增大而提高，从增加多糖得率的角度考虑，增加培养液中的多糖含量是有利的。但多糖溶液的黏度随其浓度的增加而升高，会加大超滤系统的负担，造成不必要的损失。由图7－6可以看出，多糖浓度为4g· L^－1时的多糖得率已经达到94%，可以认为4g· L^－1的多糖浓度是一个较为合适的提取浓度。

图7－7　多糖浓度对多糖得率的影响