猫爪草多糖的提取工艺研究

（一）主要仪器和试药

1．仪器　SP－2000UV型紫外可见分光光度计、离心沉淀机、冷冻干燥机。

2．试剂　葡萄糖对照品、蒽酮等相关试剂。

（二）方法与结果

利用多糖溶于水而不溶于醇等有机溶剂的特点，采用水提醇沉、Sevag法脱蛋白的方法，对猫爪草多糖进行提取和粗分离，其工艺流程图如图3－12。

图3－12　猫爪草多糖提取分离流程

1．猫爪草多糖提取分离条件的正交试验设计　针对影响多糖提取分离的主要因素如提取时间、加水倍数、提取温度、次数、醇析浓度等，试验中采用L9（34）正交设计法，以多糖得率为指标，确立多糖的提取条件。因素水平安排见表3－27，正交试验方案及结果见表3－27，表3－28。

表3－27　因素水平表

表3－28　提取工艺选择的正交试验方案和实验结果

从正交试验结果直观分析看，影响多糖提取得率因素的主次顺序为A＞B＞D＞C，即提取时间＞加水倍数＞提取温度＞醇析浓度。这3个因素的参数以提取2次，时间分别为2h，加水倍数15倍、12倍，温度为90℃，醇析浓度80%为优，其他因素影响较小。由实验结果确立最佳组合为A2B2C2D2。

2．猫爪草多糖含量测定方法的建立　多糖得率采用蒽酮－硫酸法，以葡萄糖对照品为参比进行测定计算。

（1）标准曲线的建立：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，置100ml量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液0．1ml，0．2ml，0．3ml，0．4ml，0．5ml，0．6ml，0．7ml，分别置25ml刻度试管中，准确地加水到1．0ml，分别加入蒽酮－硫酸试液5ml，充分混匀，沸水浴加热反应10min，以1．0ml蒸馏水同法操作作为空白对照，在625nm处测定吸收度。以浓度（X）为横坐标，吸收度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，在51．0～375．0μg范围内有吸收度呈良好线性，标准曲线Y＝－0．1154＋0．00314　X，r＝0．999　2（n＝7）。结果见表3－29，曲线见图3－13。

表3－29　标准曲线数据

图3－13　标准曲线图

（2）多糖的含量测定：称取60℃干燥至恒重的多糖样品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，以蒸馏水溶解并稀释至刻度。精密吸取0．3ml，置25ml试管中，准确加水至1ml，照标准曲线制备项下的方法，自“加入蒽酮－硫酸溶液5．0ml”起，依法测定吸收度。用标准曲线上计算供试样品溶液中多糖的重量（μg），计算，即得。

3．多糖粗品的脱蛋白纯化　多糖粗品中的蛋白质可用Sevag法除去，将所得多糖加水溶解制成10%糖溶液，加入适量体积适当配比的脱蛋白试剂，振荡至溶剂层无蛋白沉淀为止。为了探讨氯仿与正丁醇配比及样品体积配比，再次使用正交试验法进行优选最佳纯化方法，因素水平及结果见表3－30，表3－31。

表3－30　因素水平表

表3－31　多糖粗品纯化正交试验结果

（1）多糖得率：指Sevag法除去蛋白后所得的多糖与醇析所得粗多糖中的多糖总量之比

正交试验结果表明，影响多糖粗品纯化的主次顺序为C＞A＞B＞D，萃取次数是最重要的影响因素，5号试验纯化最好，多糖得率91．5%，最佳因素参数组合为A2B2C3，即样品与Sevag试剂体积比为1∶1，Sevag试剂配比为氯仿：正丁醇体积比为1∶0．25，萃取次数为3次。

4．猫爪草多糖提取分离工艺验证实验　称取药材100g，各5份，加入水浸泡1h，按正交试验确定的提取分离工艺（提取2次，时间分别为2h，加水倍数15倍、12倍，温度为90℃，醇析浓度80%）进行提取和除去蛋白。称取粗多糖按“多糖的含量测定”方法操作并测定含量，结果5份样品多糖的含量分别为85．98%，89．05%，90．65%，87．95%，85．92%，RSD为2．25%，表明工艺重复性好，结果稳定。

本实验综合考虑影响多糖提取及纯化的多种因素，分别采用L9（34）正交设计法，以多糖得率为指标，对猫爪草多糖的提取及纯化工艺进行了初步研究。研究结果显示，猫爪草多糖水提醇沉的最佳工艺条件为：提取2次，时间分别为2h，加水倍数15倍、12倍，温度为90℃，醇析浓度80%；多糖粗品除去蛋白的最佳因素参数为：样品与Sevag试剂体积比为1∶1，Sevag试剂配比为氯仿：正丁醇为1∶0．25，萃取次数为3次。且经验证实验工艺重复性好，结果稳定，值得推广应用。